李 翠，趙明剛，賀 芳，王曉巖，李 旭，王 翔

(1. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院：1. 轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心；2. 檢驗科，陜西西安 710061)

人體正常染色體受到某些因素影響后可發(fā)生異常改變，包括染色體數(shù)目異常和染色體結(jié)構(gòu)畸變。據(jù)報道，我國每年出生的染色體異?；純杭s10萬，在活產(chǎn)兒中，染色體異常的發(fā)生率為0.5%～1%[1]。

傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)可以檢測染色體數(shù)目異常及大于10 Mb的片段缺失、重復、倒位等結(jié)構(gòu)異常，但不能覆蓋全基因組，且常難以判斷異常染色體片段的來源[2]。染色體微陣列分析技術(shù)(chromosomal microarray analysis, CMA)可以提供高分辨率和全基因組范圍內(nèi)染色體不平衡改變的檢測，精確定位異常改變的片段[3-4]，但CMA芯片成本較高，且無法檢測探針未覆蓋的染色體區(qū)段。因此，臨床上亟需一種更經(jīng)濟準確的方法，以便全面準確地檢測染色體異常疾病?；蚪M拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing, CNV-seq)不僅可以檢測CMA芯片平臺所覆蓋的染色體疾病類型，還可發(fā)現(xiàn)芯片探針無法覆蓋的染色體的微缺失、微重復，且成本較低，重復性好[5]。

在本研究中，我們對臨床發(fā)現(xiàn)的42例疑似染色體異常患者進行CNV-seq檢測，評估CNV-seq技術(shù)在染色體疾病檢測中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月-2018年9月于西安交通大學第一附屬醫(yī)院進行門診咨詢及染色體檢查的患者42例，包括進行外周血染色體檢查的患者5例，進行羊水染色體檢查的患者37例，其中男性3例，女性39例，年齡3～38歲(平均年齡19.7歲)。

1.2 實驗方法

1.2.1外周血細胞培養(yǎng)及染色體核型分析 患者簽署知情同意書后采集外周血，2 mL EDTA抗凝血用于后續(xù)CNV-seq檢測，4 mL肝素鈉抗凝血進行常規(guī)培養(yǎng)、制片后，進行染色體G顯帶分析。

1.2.2羊膜腔穿刺及羊水染色體核型分析 患者簽署知情同意書后，在無菌條件下進行超聲下引導穿刺羊水20 mL。15 mL羊水離心后進行細胞培養(yǎng)，常規(guī)收獲制片后進行染色體G顯帶分析；5 mL羊水用于后續(xù)CNV-seq檢測。

1.2.3CNV-seq檢測 患者外周血/羊水標本進行DNA提取，構(gòu)建測序文庫并進行質(zhì)控，然后通過HiSeq 2000測序平臺進行CNV-seq檢測。

1.2.4CNV-seq檢測結(jié)果分析 將染色體全基因組測序檢測到的基因組CNV參照國際基因組CNV多態(tài)性數(shù)據(jù)庫Decipher、UCSC Genome Browser、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)、International Standards for Cytogenomic Arrays(ISCA)等以及相關(guān)文獻評估CNV是否致病。檢測報告將嚴格按照美國醫(yī)學遺傳學會指南[6]進行CNVs分級。

2 結(jié) 果

2.1 染色體核型分析結(jié)果42例標本染色體分析分辨率均在320條帶。染色體核型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共存在8例染色體異常，其中染色體結(jié)構(gòu)異常6例，數(shù)目異常2例，檢出率19.04%。此外，還檢出4例為染色體多態(tài)性變異，其余30例患者染色體核型分析均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。染色體核型分析異常患者臨床資料及檢測結(jié)果見表1。

表1 染色體核型分析異常患者的臨床資料及檢測結(jié)果

Tab.1 Clinical information and results of patients with chromosome abnormality confirmed by karyotype analysis

編號性別年齡標本類型臨床表現(xiàn)核型分析CNV-seq檢測結(jié)果臨床意義P1男3歲外周血生長發(fā)育遲滯,左手通貫掌,陰莖短小46,XY,der(3)t(3;13)(p25;q21),inv(9)matseq[hg19]del (X)(p22.31)(1.68Mb)seq[hg19]del (3)(p26.3p26.2)(3.3Mb)seq[hg19]dup(13)(q21.31q34)(51.32Mb)致病致病致病P2女15歲外周血原發(fā)閉經(jīng),幼稚子宮46,X,der(X)(q?)seq[hg19]del(X)(q21.31q28)( 66.70 Mb)seq[hg19]dup(4)(q21.21q35.2)(109.98 Mb)致病致病P3男10天外周血雙手通貫掌,先心病46,XY,del(18)(q22q23)seq[hg19]del(18)(q22.1q23)(12.94Mb)seq[hg19]dup(4)(q35.2)(3.52Mb)致病意義不明確P4女20歲外周血原發(fā)閉經(jīng)46,X,der(X)(q?)seq[hg19]del(X)(q21.32q28)seq[hg19]dup(X)(p22.33p11.23)致病致病P5男26歲外周血生殖器幼稚,先心病,左眼視網(wǎng)膜脫落47,XY,+marseq[hg19]dup(22)(q11.1q11.23)(8.54 Mb)致病P6女27歲羊水中孕期唐篩高風險47,XN,+mar未見明顯異常/P7女35歲羊水高齡產(chǎn)婦46,X,inv(Y)(p11.2q11.22)未見明顯異常/P8女32歲羊水中孕期唐篩臨界高風險46,XN,t(1;17)(q12;q23)未見明顯異常/

2.2 CNV-seq檢測結(jié)果42例標本均獲得有效的測序結(jié)果。CNV-seq結(jié)果顯示，42例標本中，染色體異常7例，檢出率為16.67%。在傳統(tǒng)染色體核型分析檢出的6例染色體結(jié)構(gòu)異常中，CNV-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)4例存在CNVs；而2例染色體數(shù)目異?；颊咧?，1例存在CNV(表1)。在染色體核型分析結(jié)果正常的30例患者中，CNV-seq發(fā)現(xiàn)2例患者存在片段<10 Mb的CNV變化，其中1例檢測結(jié)果判讀為可能致病的CNV，相關(guān)臨床資料及檢測結(jié)果見表2。此外，對染色體核型分析發(fā)現(xiàn)的4例染色體多態(tài)性變異進行CNV-seq檢測，均未檢出100 kb以上已知的、明確致病的CNV, 相關(guān)臨床資料及檢測結(jié)果見表3。

表2 2例CNV<10 Mb的重復或缺失患者的臨床資料及檢測結(jié)果

Tab.2 Clinical information and results of two patients with chromosome microdeletion and microduplication

編號性別年齡標本類型臨床表現(xiàn)核型分析CNV-seq檢測結(jié)果臨床意義P9女28歲羊水B超示脈絡叢囊腫46,XNseq[hg19]del(1)(q44)(0.32Mb)seq[hg19]del(7)(p21.1)(0.14Mb)意義不明確P10女32歲羊水近親婚配46,XNseq[hg19]dup(15)(q11.2q13.1)(5.76Mb)可能致病

表3 4例染色體多態(tài)性變異患者的臨床資料及檢測結(jié)果

Tab.3 Clinical information and results of four patients with chromosome polymorphism

編號性別年齡標本類型臨床表現(xiàn)核型分析CNV-seq檢測結(jié)果臨床意義變異來源P11女37歲羊水高齡46,XN,22ps-未見明顯異常/父親P12女31歲羊水B超示脈絡叢囊腫46,XN,14pstk+未見明顯異常/母親P13女27歲羊水B超示腸管回聲增強46,XN,9qh+未見明顯異常/父親P14女41歲羊水不良孕產(chǎn)史46,XN,inv(9)(p12q13)未見明顯異常/父親

2.3 隨訪本次研究病例中，共對42例患者進行了染色體核型分析和CNV-seq檢測，其中外周血染色體檢查的患者5例，羊水染色體檢查的患者37例，對所有的患者進行常規(guī)隨訪。37例羊水染色體檢查的患者中，1例選擇引產(chǎn)，由于在外院引產(chǎn)，未能獲取進一步引產(chǎn)情況。其余36位孕婦均已產(chǎn)下表型正常、發(fā)育良好的健康活嬰，但由于嬰兒較小，可能有些表型還未表現(xiàn)出來，我們將會繼續(xù)跟蹤隨訪。5例外周血染色體檢查的患者均進入針對性的臨床治療階段。

3 討 論

染色體的數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常所致的疾病稱染色體異常。染色體異常通常表現(xiàn)為先天性智力低下、發(fā)育滯后、多發(fā)畸形、性發(fā)育不全、反復流產(chǎn)及不孕不育等。據(jù)文獻報道，6.7%～21.4%出生缺陷患兒是由染色體畸變引起的[7]。雖然染色體異常與疾病的關(guān)系越來越明顯，但目前診斷染色體疾病的金標準仍是染色體核型分析。

染色體核型分析是一種經(jīng)典的遺傳學檢測技術(shù)，檢測步驟相對復雜，技術(shù)性要求較強，且分辨率較低。此外，細胞生長狀態(tài)、顯帶水平及操作人員的技術(shù)水平均會影響最終的實驗結(jié)果。隨著分子遺傳學技術(shù)快速發(fā)展，熒光定量PCR技術(shù)(quantitative fluorescent polymerase chain reaction, QF-PCR)、熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridization, FISH)等已逐漸應用于臨床檢測中[8-9]。然而，無論是染色體核型分析、QF-PCR，還是FISH檢測，都無法對來源未知的染色體片段及染色體微缺失微重復進行快速有效的鑒別。因此，臨床急需一種高通量、低成本、易操作的檢測技術(shù)，以對染色體異常進行快速診斷。

近些年，高通量測序技術(shù)迅猛發(fā)展，極大地推動了分子技術(shù)在臨床產(chǎn)前篩查、遺傳病檢測、腫瘤檢測、微生物病原體檢測及器官移植排斥篩查等方面的應用[10]。高通量測序技術(shù)又稱下一代測序(next generation sequencing, NGS)，是一種直接測序法，能在同一時間對上百萬DNA片段進行測序，大大提高了測序效率。與傳統(tǒng)的染色體核型分析及CMA檢測相比，CNV-seq技術(shù)以高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)，無需細胞培養(yǎng)，且不受探針種類及通量的限制，具有檢測范圍廣、操作簡便、通量高及成本低等優(yōu)勢[11]。國內(nèi)外研究者均對CNV-seq技術(shù)的臨床適用性及準確性進行了評估，結(jié)果表明，CNV-seq技術(shù)可應用于流產(chǎn)物分析及產(chǎn)前診斷方面[12-13]。2019年4月，《低深度全基因組測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應用專家共識》指出，CNV-seq技術(shù)可以彌補染色體核型分析和CMA的不足，對于染色體病高風險胎兒，CNV-seq技術(shù)可作為一線產(chǎn)前診斷方法。但是，CNV-seq技術(shù)不能檢測三倍體及多倍體，無法發(fā)現(xiàn)染色體互相易位、倒位等染色體結(jié)構(gòu)重排，且無法檢測雜合性缺失(包括單親二倍體)[14]。

本研究中，采用傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)對42例患者進行常規(guī)染色體分析發(fā)現(xiàn)，8例存在染色體異常，其中6例患者為染色體結(jié)構(gòu)異常，2例為染色體數(shù)目異常。同時，利用CNV-seq技術(shù)對這42例患者標本進行高通量測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于染色體核型分析確診的6例染色體結(jié)構(gòu)異常的患者，CNV-seq發(fā)現(xiàn)其中4例存在基因的CNVs。將檢測到的CNVs參照國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫及相關(guān)參考文獻進行致病性評估發(fā)現(xiàn)，除其中1個CNV臨床意義暫不明確外，其余均是明確致病的。4例存在異常CNVs患者中，P1父親染色體正常，母親染色體核型為46,XX,t(3;13)(p25;q21),inv(9)，由此可推測P1患者異常核型來源于其母親；其余3例患者家屬拒絕家系調(diào)查，未能獲得患者異常染色體來源。在染色體核型分析結(jié)果正常的30例患者中，CNV-seq還發(fā)現(xiàn)2例患者存在片段<10 Mb的CNVs，其中1例檢測結(jié)果判讀為可能致病的CNV。

此外，染色體核型分析還發(fā)現(xiàn)4例染色體多態(tài)性變異。有研究指出，染色體多態(tài)性具有引起流產(chǎn)、不孕不育等生殖異常遺傳效應[15-16]。但目前對于多態(tài)性引起的生殖異常，還需進一步在分子水平進行研究。為了排除本研究中發(fā)現(xiàn)的4例染色體多態(tài)性攜帶其他染色體CNV，我們將標本同時進行CNV-seq檢測，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)明顯異常CNV改變。

綜上所述， CNV-seq技術(shù)克服了現(xiàn)有染色體診斷技術(shù)的缺點，能夠快速、準確地為染色體異?；颊咛峁└鼮樵敿毜呐R床檢測信息。尤其對染色體核型分析不能明確診斷的染色體片段，CNV-seq檢測能協(xié)助確定其所涉及的區(qū)帶。因此，對于染色體病患者和高危人群進行CNV-seq聯(lián)合染色體核型分析檢測，能為患者提供更為詳細準確的臨床診斷，從而為遺傳咨詢和生育指導提供依據(jù)。