戚家明 孫杉杉 張東旭 徐志文 徐延平

（1. 河北省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，秦皇島 066004；2. 河北省農(nóng)業(yè)廳植物營養(yǎng)與海洋功能肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島 066004；3. 領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司，秦皇島 066004；4. 秦皇島領(lǐng)先康地農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司，秦皇島 066400）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是芽孢桿菌屬中的一種好氧革蘭氏陽性菌［1］?？莶菅挎邨U菌是一種廣泛分布植物根際的有益微生物，能夠產(chǎn)生很多抗菌譜廣的具有抗菌活性的物質(zhì)防治植物病害，具有良好的病害防治能力［2］。又因?yàn)榭莶菅挎邨U菌可以產(chǎn)生繁殖能力和抗逆性極強(qiáng)的芽孢休眠體，所以越來越多的枯草芽孢桿菌菌株被開發(fā)為微生物菌劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

枯草芽孢桿菌擁有著廣泛的抑菌譜，具有較強(qiáng)的抑制病原菌生長的能力，其主要原因在于它可以分泌多種拮抗類物質(zhì)，其中有通過非核糖體合成的低分子抗菌肽以及通過核糖體合成的大分子蛋白類細(xì)菌素［3］，通過非核糖體途徑合成的細(xì)菌素包括低分子量的伊枯草菌素（Iturin）、抗菌肽表面活性素（Surfactin）、芬枯草菌素（Fengycin）、溶桿菌素（Bacilysin）、Bacillaene、Rhizocticin 和 Mycobacillin等；通過核糖體途徑合成的細(xì)菌素包括 Subtilin、Mersacidin、Ericin、Sublancin 和 Subtilosin A 等［4-5］。

隨著近現(xiàn)代測序技術(shù)的進(jìn)步，尤其二代測序（Next generation sequencing，NGS）技術(shù)的出現(xiàn)以及測序成本的下降，為研究枯草芽孢桿菌提供了新的方法。利用全基因組序列信息對(duì)枯草芽孢桿菌近緣種群進(jìn)行分類鑒定和抗性潛力快速挖掘具有快捷和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)?？莶菅挎邨U菌類群間的親緣關(guān)系較近，16S rRNA序列相似度太高從而導(dǎo)致區(qū)分度較低［6］，為了解決16S rRNA區(qū)分度低的問題，有研究在細(xì)菌的基因組中挑選了如gyrA［6］、rpoB［7］及gyrB［8］等在系統(tǒng)進(jìn)化過程中保守但又具有相對(duì)較快的變異速率的基因作為補(bǔ)充。相比于單一基因分析，基于基因組水平的平均核苷酸一致性（Average nucleotide identity，ANI）［9-11］分析和 DNA 同源性（DNA-DNA hybridization，DDH）［12］分析對(duì)于枯草近緣種群具有更高的區(qū)分度。在挖掘次級(jí)抗菌代謝產(chǎn)物方面，antiSMASH在線工具自發(fā)布以來，在挖掘次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，成為了應(yīng)用最廣泛的挖掘次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇的應(yīng)用工具［13］。

本試驗(yàn)對(duì)從土壤中分離到的一株具有良好生防效果的芽孢桿菌BS-6進(jìn)行研究，通過拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BS-6對(duì)病原真菌的生長具有良好的抑制效果，通過全基因組測序得到BS-6的全基因組信息，結(jié)合16S rRNA序列、gyrA基因序列、平均核苷酸一致性（ANI）及DNA 同源性（DDH）綜合分析可以對(duì)芽孢桿菌BS-6的分類地位進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，利用antiSMASH在線工具對(duì)BS-6的抑菌相關(guān)功能基因進(jìn)行分析探索其拮抗特性，為芽孢桿菌BS-6的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：芽孢桿菌菌株BS-6，該菌株為土壤中篩選到具有較好生防效果的根際微生物，由領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司分離并保存。

植物病原真菌：馬鈴薯枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和蘋果輪紋病菌（Botryospuaeria berengerianade Not.），由領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司分離并保存。

主要培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基，蛋白胨 10.0 g/L、酵母粉 5.0 g/L、氯化鈉 10.0 g/L，pH=7；PDA培養(yǎng)基，馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L。

1.2 方法

1.2.1 植物病原真菌拮抗試驗(yàn) 采用平板對(duì)峙法，首先在平皿中間分別放置馬鈴薯枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和蘋果輪紋病菌（Botryospuaeria berengerianade Not.）等3種植物病原菌的菌絲塊。然后在菌絲塊四周滴加10 μL BS-6的菌懸液，每種病原菌重復(fù)3次拮抗試驗(yàn)，設(shè)不接種BS-6的空白對(duì)照，于培養(yǎng)箱中20℃培養(yǎng)5 d。根據(jù)下列公式計(jì)算BS-6對(duì)植物病原菌的生長抑制率：

1.2.2 芽孢桿菌BS-6的全基因組測序 將BS-6接于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，在4℃下4 500 r/min離心10 min，舍去上清液收集菌體，利用液氮冷凍保存送至北京諾禾致源科技股份有限公司（Beijing Novogene Bioinformatics Technology Co.，Ltd）進(jìn)行全基因組測序，獲得其全基因組序列，將BS-6的全基因組信息上傳至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），獲得登錄號(hào)為SSXZ00000000。

1.2.3 16S rRNA 及gyrA基因序列分析 根據(jù)全基因組注釋信息，選擇16S rRNA和gyrA基因序列分別提交至ezbiocloud.net數(shù)據(jù)庫及NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，利用MEGA 7.0.26軟件Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 ANI 和 DDH 分析 使用 Jspecies（http：//jspecies.ribohost.com/jspeciesws//） 中 的 Mummer［14］對(duì)研究中的菌株全基因組進(jìn)行平均核苷酸一致性（Average nucleotide identity，ANI）值的計(jì)算。使用Genome-to-Genome Distance Calculation（http：//ggdc.dsmz.de/distcalc2.php）［15］對(duì)研究中的菌株全基因組進(jìn)行DDH值的計(jì)算

1.2.5 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析 本研究利用antiSMASH 3.0［16］bacterial version（https：//antismash.secondarymetabolites.org/）對(duì)BS-6菌株中次生代謝物合成基因組簇進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 植物病原真菌拮抗試驗(yàn)

拮抗試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，BS-6對(duì)馬鈴薯枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和蘋果輪紋病菌（Botryospuaeria berengerianade Not.）的生長均具有良好抑制效果，抑菌率分別為80.00%、68.79%和76.19%。其中BS-6對(duì)馬鈴薯枯萎病的病原微生物尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）具有顯著的抑菌效果。

圖1 BS-6對(duì)馬鈴薯枯萎病菌（A）、蘋果輪紋病菌（B）和玉米紋枯病菌（C）的抑制效果

2.2 菌株BS-6的分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 基于16S rRNA 序列比對(duì)結(jié)果的系統(tǒng)進(jìn)化分析 經(jīng)全基因組測序，獲得芽孢桿菌BS-6基因組草圖，上傳至NCBI獲得登錄號(hào)為SSXZ00000000，基因組大小為3.99 Mb，GC含量為43.84%。將全基因組中注釋到的16S rRNA序列提交至ezbicloud和NCBI的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，選取部分同源性高于99%的菌株序列利用MEGA7軟件的鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（相似度重復(fù)計(jì)算1 000次）。芽孢桿菌BS-6基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。根據(jù)比對(duì)結(jié)果與菌株BS-6同源性高于99%的菌株均為芽孢桿菌屬，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示BS-6與模式菌株Bacillus halotoleransATCC 25096聚為一類，但bootstrap 支持值較低，可以確定BS-6為芽孢桿菌屬，無法準(zhǔn)確鑒定BS-6到種。

2.2.2 基于gyrA基因序列 BLAST 結(jié)果的系統(tǒng)進(jìn)化分析 將測序得到的gyrA基因序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST分析，選取2株同源性較高的序列，同時(shí)根據(jù)16S rRNA比對(duì)結(jié)果選取其中具有g(shù)yrA基因序列信息的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，BS-6與Bacillus subtilissubsp.spizizeniiW23聚為一類。

2.2.3 ANI 和 DDH 分析 選擇在16S rRNA 序列和gyrA基因序列比對(duì)中的具有全基因組序列數(shù)據(jù)的模式菌株與BS-6進(jìn)行ANI及DDH分析，該9株芽孢菌的ANI值及DDH值結(jié)果如表1所示。

其中BS-6與模式菌株Bacillus subtilissubsp.spizizeniiTU-B-10的ANI值為96.72%，高于網(wǎng)站給出的95%的種間鑒定標(biāo)準(zhǔn)。BS-6與模式菌株Bacillus subtilissubsp.spizizeniiTU-B-10的DDH值為71.70%高于網(wǎng)站給出的70%的種間鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.4Bacillus subtilisBS-6次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析 將Bacillus subtilisBS-6的全基因組序列上傳至在線軟件antiSMASH中進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析，共發(fā)現(xiàn)有11個(gè)與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因簇。同時(shí)對(duì)2.2.3中參與分類的芽孢菌株進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析，對(duì)基因組中已知功能的基因簇進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

圖2 基于16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果構(gòu)建的菌株BS-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于gyrA序列比對(duì)結(jié)果構(gòu)建的菌株BS-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 BS-6及其近緣菌種平均核苷酸一致性（ANI）和DNA同源性分析（DDH）數(shù)值

Bacillus subtilisBS-6與親緣關(guān)系較近的Bacillus subtilissubsp.spizizeniiTU-B-10具有類似的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇組成，Bacillus subtilisBS-6中具有7個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇，且均具有抗菌作用，其中Mycosubtilin和Rhizocticin為Bacillus subtilisBS-6及其親緣種特有的次級(jí)抗菌代謝產(chǎn)物合成基因簇。

表2 BS-6及其近緣菌種基因組中已知功能的基因簇?cái)?shù)量統(tǒng)計(jì)

3 討論

植物病害一直以來都是影響糧食產(chǎn)量的重要因素，傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥防治對(duì)病害控制具有速效性，但隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，病原微生物的耐藥性和農(nóng)藥殘留產(chǎn)生的“副作用”也日益嚴(yán)重。近年來綠色高效的生物防治作為防治植物病害的重要措施逐漸受到人類的重視。其中芽孢桿菌特別是枯草芽孢桿菌作為生物防治的代表菌株具有良好的生防效果，被廣泛的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

本團(tuán)隊(duì)從植物連作根際土壤中分離到了一株芽孢桿菌BS-6，前期溶血試驗(yàn)表明其溶血活性微弱，具有較高的安全性，經(jīng)過應(yīng)用試驗(yàn)和拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有良好的應(yīng)用效果，本試驗(yàn)通過全基因組測序得到了BS-6的基因組序列，結(jié)合相關(guān)軟件分析確定了BS-6的分類地位及其抗病防病能力的分析。

16S rRNA基因是細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和種屬鑒定的常用分類工具［17］，但是枯草芽孢桿菌類群間的親緣關(guān)系較近，導(dǎo)致16S rRNA序列區(qū)分度降低無法準(zhǔn)確區(qū)分近緣種群［18］，在本研究中利用BS-6的16S rRNA基因序列無法將其與其他芽孢桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，為了準(zhǔn)確鑒定BS-6的分類地位，首先挑選了gyrA基因作為分類工具，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)BS-6與枯草芽孢桿菌聚為一類。又對(duì)BS-6及其親緣種的平均核苷酸一致性（ANI）及DNA同源性（DDH）進(jìn)行了分析，可以準(zhǔn)確將BS-6鑒定為枯草芽孢桿菌?；诨蚪M水平的ANI和DDH分析驗(yàn)證了gyrA基因分析的結(jié)果，這表明gyrA基因作為枯草芽孢桿菌近緣種的分類工具具有良好的區(qū)分度。

antiSMASH是一種能夠較完整的預(yù)測細(xì)菌和真菌次生代謝產(chǎn)物基因簇的在線生物信息學(xué)工具，特別是與生物抗生素合成有關(guān)的基因簇。本研究將與BS-6親緣關(guān)系較近的幾株芽孢桿菌的基因組提交至antiSMASH，對(duì)這幾株親緣關(guān)系較近的芽孢菌中的次生代謝產(chǎn)物基因簇進(jìn)行分析，對(duì)比其在抑菌抗病方面的潛力大小。BS-6具有最多的7種生物抗生素合成有關(guān)的基因簇?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生抗菌肽的途徑主要包括核糖體途徑和非核糖體2條途徑。BS-6中的抗菌肽核糖體途徑合成的抗菌肽主要有：常見的羊毛硫細(xì)菌素Subtilin；稀有的羊毛硫細(xì)菌素類有Subtilosin A 等；非核糖體途徑合成的抗菌物質(zhì)主要有 Surfactin、Mycosubtillin、Rhizocticin和Bacillibactin 等［4-5］。

Subtilin是一類含有帶正電荷的A類羊毛硫細(xì)菌素，對(duì)于革蘭氏陽性菌具有很強(qiáng)的抑制活性［19-21］；Subtilosin A是一種抑菌譜非常廣的抑菌肽，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌、肺炎克氏桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用［22-23］。

Surfactin是許多芽孢桿菌中都存在的廣譜抗菌物質(zhì)，同時(shí)也是一種很強(qiáng)的表面活性劑［24-25］，具有雙重身份的 Surfactin 具有乳化、發(fā)泡［26］，抗病毒［27］、抗支原體、抗致病真菌、抗李斯特菌和殺幼蟲的作用［28-30］。Bacillibactin是一種枯草芽孢桿菌分泌出來的對(duì)鐵離子具有高親和性的螯合劑，可以競爭性結(jié)合環(huán)境中對(duì)于病原菌生長和發(fā)揮活性必須的可溶性鐵離子［31］。Bacillaene是由芽孢桿菌分泌的一種多聚烯類抗生素抑菌物質(zhì)，主要抑制原核生物蛋白質(zhì)的合成［32-33］。

相比于其它近緣種，抗菌物質(zhì)Mycosubtillin和Rhizocticin的合成基因簇是BS-6基因組中特有的，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道該兩種物質(zhì)均具有較強(qiáng)的抑制真菌活性［34-36］。其中 Mycosubtillin對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、白色念珠菌（Candida albicans）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和熱帶念珠菌（Candida tropicalis）具有抑菌活性［34，37-38］。

拮抗試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS-6對(duì)于真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，尤其對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的抑制效果最為顯著，說明BS-6在防治由尖孢鐮刀菌引發(fā)的植物病害時(shí)可能具有良好的效果，具有較大的應(yīng)用潛力。

除以上7種芽孢桿菌屬重要或特有的次生代謝產(chǎn)物基因簇外，BS-6中還存在4種功能未知的基因 簇， 其 中CDPS（tRNA-dependent cyclodipeptide synthases）類1種，T3PKS（Type III PKS）類1種，萜類（Terpene）2種，這表明BS-6中可能存在具有合成新的抑菌物質(zhì)的基因簇，BS-6具有較大的農(nóng)業(yè)應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

本研究通過全基因組測序得到了芽孢桿菌BS-6的基因組序列，通過對(duì)BS-6的16S rRNA基因、gyrA基因、平均核苷酸一致性及DNA 同源性分析可以準(zhǔn)確將BS-6鑒定為枯草芽孢桿菌。通過antiSMASH在線工具對(duì)BS-6中次生代謝產(chǎn)物基因簇進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)11個(gè)相關(guān)基因簇，其中7種為芽孢桿菌屬重要或特有的次生代謝產(chǎn)物基因簇，具有較強(qiáng)的抑制病原微生物生長的功能。本研究通過基因組分析發(fā)現(xiàn)菌株BS-6具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力，為其在生物防治及大田作物抗病和增產(chǎn)方面的應(yīng)用方面提供了理論依據(jù)。