李芬 李麗江 徐丹旎 陳春林 王瑋 李梅

（1. 滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)普洱茶學(xué)院，普洱 665000；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，勐海 666201）

咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea genus）植物，該屬主要為二倍體和四倍體［1］。主要種植的有小粒種（Coffee arabica）、中粒種（Coffee robusta）和大粒種（Coffee liberica）［2-4］。其中，由于小粒種咖啡品質(zhì)較好，生產(chǎn)規(guī)模較大，其產(chǎn)量達(dá)到全球咖啡產(chǎn)量的73%，已成為很多地區(qū)獨具優(yōu)勢的特色經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)。

咖啡中含有咖啡堿，適量攝入對身體有益，過多則有害。咖啡樹中，咖啡堿主要在嫩葉中合成?？Х扔酌绲娜~片和子葉含咖啡堿，而根部和成熟枝條的褐色部分不含咖啡堿［5］。目前，從咖啡樹中已克隆獲得一系列與咖啡堿合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，包括7-黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶基因（7-methylxanthosine synthase，CaXMT1）［6］、可可堿合成酶基因CaMXMT、咖啡堿合成酶基因（Coffee caffeine synthase，CaDXMT1）［7］和雙功能酶基因（Bifunctional coffee coffeine synthase，CCS1）［8］等。盡管這些酶的氨基酸系列組成具有很大的相似性（＞80%），但是底物專一性差異性較大［6］。

目前，對小粒咖啡樹不同組織不同發(fā)育時期（嫩葉、成熟葉片、幼果和成熟鮮果）CaXMT1、CaDXMT1、CCS1相對表達(dá)量差異，以及這3個關(guān)鍵基因的表達(dá)與咖啡堿含量關(guān)系的研究報道甚少。

本研究采用qRT-PCR方法測定咖啡樹不同組織中咖啡堿合成途徑3個關(guān)鍵酶基因（CaXMT1、CaDXMT1和CCS1）的相對表達(dá)量，并將其與各組織中的咖啡堿含量進(jìn)行相關(guān)性分析，從而探究這3個基因的mRNA相對表達(dá)量與咖啡堿含量的關(guān)系，進(jìn)一步探討小粒種咖啡豆中咖啡堿合成機(jī)理，為咖啡樹的育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年11月，在云南省普洱市南島河進(jìn)行樣品采集，采集生長狀況一致的小粒種（Coffeearabica）咖啡品種植株嫩葉、成熟葉片、幼果和成熟鮮果4個部位。采摘后，每個部位選取部分樣品置于液氮中冷凍，之后于-80℃保存；剩余樣品干燥至恒重，用研磨機(jī)研磨至粉末狀，并過200目篩，聚乙烯自封袋密封備用。

1.2 方法

1.2.1 小粒咖啡樹不同部位咖啡堿含量的HPLC測定

（1）樣品提取 按照HPLC測定植物樣中咖啡堿含量的樣品提取方法［9-10］，稱取0.167 g粉末狀樣品，放入15 mL離心管中，加入10 mL超純水。將離心管放入水浴鍋中100℃浸提20 min。然后4 000 r/min離心5 min。提取上清液至50 mL容量瓶中，定容至50 mL。經(jīng)0.22 μL水系濾膜過濾，-20℃保存。

（2）HPLC色譜條件 色譜柱：Amethyst C18-H（4.6×250 mm）；流動相：甲醇∶水（40∶60）；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.5 mL/min；檢測波長280 nm；進(jìn)樣時間：15 min。

1.2.2 關(guān)鍵酶基因的qRT-PCR檢測

（1）RNA提取及cDNA合成 選取小?？Х雀鞑课粯悠罚謩e加入PVPP及液氮充分研磨；各取約20 mg研磨試樣，加入900 μL CTAB提取液及50 μL β-巰基乙醇，65℃ 30 min；用 RNA 提取試劑盒提取總RNA。使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa D6110S）合成第一鏈cDNA。

（2）基因表達(dá)量測定 qRT-PCR反應(yīng)體系（20μL）為 SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa DR081A）10.0 μL、PCR forward ＆ reverse primer（10 μmol/L）各 0.8 μL、cDNA 1st Strand（100 ng/μL）2 μL 和 ddH2O 6.4 μL。qRT-PCR 程序為 95℃ 30 s；95℃ 5 s，62℃ 30 s，40個循環(huán)。在65-95℃建立溶解曲線。以GAPDH作為內(nèi)參基因［11］，用2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2013、SPSS及Origin8.5軟件分析處理試驗數(shù)據(jù)。

表1 小粒種咖啡樹咖啡堿合成途徑3個關(guān)鍵酶基因的引物序列

2 結(jié)果

2.1 小?？Х葮洳煌M織咖啡堿含量的HPLC法測定

咖啡堿出峰時間為8.85 min。色譜峰面積（y）與濃度（x，mg/mL）的線性回歸方程為y=2.10×105x+6.70×105，r2=0.999 4。云南小粒種咖啡植株中的咖啡含量范圍為0.62%-1.52%，其中，成熟葉片中的咖啡堿含量最低，嫩葉中的最高（表2，圖1），達(dá)到1.22%±0.18%，嫩葉中的咖啡堿含量是成熟葉片中的1.8倍。小粒種咖啡植株不同組織不同發(fā)育時期咖啡堿含量順序表現(xiàn)為嫩葉＞幼果＞成熟鮮果＞成熟葉片，且嫩葉和幼果中的咖啡堿含量分別顯著高于成熟葉片（P=0.001）和成熟鮮果（P=0.007）中的。

2.2 小?？Х葮洳煌M織間3個關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量差異

由表3可知，云南小粒種咖啡中的CCS1相對表達(dá)量范圍為1.03-2.38，不同組織的CCS1相對表達(dá)量順序為嫩葉＜成熟葉片＜幼果＜成熟鮮果；CaDXMT1的表達(dá)量范圍為1.08-2.82，不同組織的相對表達(dá)量順序為嫩葉＜成熟葉片＜成熟鮮果＜幼果；CaXMT1相對表達(dá)量范圍為1.34-2.29，不同組織的相對表達(dá)量順序為：嫩葉＜幼果＜成熟葉片＜成熟鮮果。CaXMT1和CaDXMT1在嫩葉和成熟葉片中的相對表達(dá)量存在極顯著性差異（P＜0.01），而幼果和成熟鮮果之間僅僅只有CaXMT1存在極顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 小粒種咖啡樹不同組織咖啡堿含量

表3 小粒種咖啡樹咖啡堿合成途徑3個關(guān)鍵酶基因的相對表達(dá)量

2.3 基因表達(dá)量與咖啡堿含量的相關(guān)性分析

由圖2可知，CaXMT1在成熟葉片和成熟鮮果中的相對表達(dá)量隨著咖啡堿含量的增加而增加，其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.25和0.15。然而，CaXMT1在嫩葉和幼果中的相對表達(dá)量隨著咖啡堿含量的增加而呈降低趨勢，其相關(guān)系數(shù)分別為0.30和0.93，且在幼果中顯著負(fù)相關(guān)（P=0.004）。

CaDXMT1相對表達(dá)量在嫩葉、成熟葉片、幼果和成熟鮮果中的相對表達(dá)量隨著咖啡堿含量的增加均呈增加趨勢，其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.20、0.067、0.33和0.084。

CCS1在嫩葉和成熟鮮果中的相對表達(dá)量隨著咖啡堿含量的增加而呈增加趨勢，其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.15和0.32。而在成熟葉片和幼果中則隨著咖啡堿含量的增加呈現(xiàn)降低的趨勢，其相關(guān)系數(shù)R2分別為 0.29和0.24。

圖2 小粒種咖啡樹咖啡堿合成途徑關(guān)鍵酶基因CaXMT1、CaXMT1及CCS1相對表達(dá)量與咖啡堿含量的相關(guān)性

3 討論

本研究中云南小粒種咖啡植株葉片咖啡堿含量范圍為0.62%-1.52%，均值為0.94%±0.32%；果實中為0.84%-1.18%，均值為0.98%±0.10%；前人研究結(jié)果表明，小?？Х鹊拇蠖鄶?shù)品種的咖啡豆中咖啡堿含量約為1.0%。本研究結(jié)果與前人報道的含量相符［12］。植物中的咖啡堿99%存在于葉片中［13-15］，且植物中咖啡堿合成的主要部位是葉綠體，合成后的咖啡堿與綠原酸結(jié)合成復(fù)合物儲存在細(xì)胞液泡中［16-17］，根和莖中幾乎不能合成咖啡堿［18］，植物中咖啡堿不同組織含量分布規(guī)律為幼嫩新梢＞莖梗＞花果［19］。葉片中咖啡堿的合成主要在幼葉中進(jìn)行，隨著葉齡的增加，合成速率降低［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)除了CaXMT1在嫩葉和幼果中的相對表達(dá)量分別顯著低于成熟葉片和鮮果（P＜0.01）中的，且在幼果中相對表達(dá)量與咖啡堿含量顯著負(fù)相關(guān)（R2=0.93，P＜0.01）以外，其他基因的相對表達(dá)量在嫩葉和成熟葉片、幼果和成熟鮮果中的差異性不明顯。3個關(guān)鍵酶基因在不同組織不同發(fā)育時期表達(dá)的差異性，可能與這3個酶的特性以及咖啡堿合成途徑中關(guān)鍵酶基因調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性相關(guān)［6-8，20-21］。在咖啡堿合成過程中，主要包括4個反應(yīng)步驟（表4）、3個甲基化反應(yīng)步驟及一個脫核苷反應(yīng)步驟。咖啡堿合成過程中，首先是在N7甲基轉(zhuǎn)移酶（CmXRS1和CaXMT1）的催化下，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，黃嘌呤核苷合成7-甲基黃嘌呤核苷［21］。其次是在脫核苷酶的催化下，7-甲基黃嘌呤核苷脫核苷，目前，脫核苷酶基因未被克隆［22-23］，估計7-甲基轉(zhuǎn)移酶在催化黃嘌呤核苷甲基化的同時，催化7-甲基黃嘌呤核苷脫除核苷［24］。然后，在N3甲基轉(zhuǎn)移酶基因CTS和CaMXMT的調(diào)控下，7-甲基黃嘌呤合成可可堿（3，7-二甲基黃嘌呤）［20-21］。最后，可可堿在N1甲基轉(zhuǎn)移酶基因（CCS1和CaDMXT1）的調(diào)控下合成咖啡堿［6］。

這些咖啡堿合成關(guān)鍵酶基因的氨基酸序列相似性（＞80%）較大，且其分子量及編碼的多肽氨基酸組成個數(shù)差異性小，底物專一性卻差異較大［6］。如黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶基因（XMT/CmXRS），其編碼的多肽由372個氨基酸組成，且分子量為41.8 kD?？煽蓧A合成酶基因MXMT1（42.7 kD）、MXMT2及CTS2（43.4 kD），其編碼的多肽分別由378、384個氨基酸組成，多肽分子量及氨基酸組成個數(shù)相似，但催化特性差異性大?？赡芘c不同的酶具有不同的催化特性有關(guān)，而酶的催化特性與其動力學(xué)參數(shù)Km相關(guān)性較大。如咖啡堿合成酶DXMT和CCS1，其編碼的多肽分子量（43 kD）及氨基酸個數(shù)（384）相同，但其動力學(xué)參數(shù)差異性較大，在調(diào)控可可堿合成咖啡堿的過程中，其動力學(xué)參數(shù)Km值分別為1 200和 157 μmol/L，DXMT的Km值 是CCS1的 8倍［8，20-21］。而且，CCS1能夠利用7-甲基黃嘌呤、3，7-二甲基黃嘌呤及1，7-二甲基黃嘌呤合成咖啡堿，具有N1及N3甲基化的雙功能［21］，其中，1，7-二甲基黃嘌呤為其最活躍的底物，對1，7-二甲基黃嘌呤的催化活性是對可可堿的3倍［26-27］。但在咖啡植物中1，7-二甲基黃嘌呤的含量較少。因此，咖啡堿的合成主要是7-甲基黃嘌呤通過合成可可堿而合成咖啡堿。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)咖啡堿合成途徑中的幾個關(guān)鍵酶基因在細(xì)胞中既可以形成同源二聚體，也可形成異源二聚體，且檢測異源二聚體有雙重活性，這可能是有利于咖啡堿的快速合成［28］。通過咖啡堿合成途徑中幾個關(guān)鍵酶特性的差異性，可知咖啡堿的合成途徑是一個復(fù)雜的過程，與酶底物的可利用性以及濃度等密切相關(guān)［6-8，20-21］。

表4 咖啡堿合成途徑中的N-甲基轉(zhuǎn)移酶及編碼基因［25］

咖啡堿合成途徑中的3個甲基化反應(yīng)，需要有嘌呤環(huán)、甲基供體以及甲基載體四氫葉酸。植物中咖啡堿的量，除了與這3個關(guān)鍵酶基因的相對表達(dá)量，可能還與嘌呤環(huán)、甲基供體以及甲基載體四氫葉酸的合成量相關(guān)?？Х葔A結(jié)構(gòu)中的甲基和黃嘌呤核苷分別經(jīng)過不同的途徑組合，目前已發(fā)現(xiàn)的黃嘌呤核苷的合成可通過4條途徑［29］，分別是核糖-5-磷酸途徑、腺嘌呤核苷酸途徑、鳥嘌呤核苷酸途徑和S-腺苷甲硫氨酸循環(huán)途徑。其嘌呤環(huán)的合成途徑中受多種酶基因的調(diào)控，F(xiàn)ujimori等［30］研究表明，腺嘌呤核苷脫氨酶促進(jìn)腺嘌呤核苷酸合成嘌呤環(huán)進(jìn)而提高咖啡堿的合成量。咖啡堿結(jié)構(gòu)中的3個甲基由S-腺苷蛋氨酸提供［31］，且在嘌呤環(huán)甲基化的過程中，四氫葉酸接受來自S-腺苷蛋氨酸的甲基，變成N5-甲基四氫葉酸，在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，攜帶甲基的四氫葉酸將甲基轉(zhuǎn)移到嘌呤環(huán)上去，從而完成甲基化作用［32］，而這一轉(zhuǎn)甲基的過程中，受到蛋白質(zhì)代謝的影響［33］，這與蛋白質(zhì)代謝旺盛的嫩葉中咖啡堿含量最多的現(xiàn)象也相符。

然而，小粒咖啡樹中不同部位咖啡堿的含量除受基因的調(diào)控外，還受到光照、溫度、氮素、鉀離子濃度、季節(jié)等環(huán)境因子的影響。前人應(yīng)用碳同位素示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，光通過溫度間接影響酶的活性，強(qiáng)光和大量日照，通過加速氨基酸的分解，進(jìn)而抑制咖啡堿的合成［34-35］。關(guān)于季節(jié)，研究表明，秋季茶樹新稍中的咖啡堿含量低于春夏兩季［36］。氮肥通過增加氨基酸的含量來增加咖啡堿的合成量［37-38］。鉀肥則通過提高酶的活性來增加咖啡堿的含量［39-42］。海拔也影響咖啡堿的合成，Owuor等［43］研究表明，隨著海拔的增加，茶葉中的咖啡堿含量增加。劉建軍等［44］通過對茶葉進(jìn)行不同遮陰方式的處理，發(fā)現(xiàn)遮陰能夠增加茶葉氨基酸、咖啡堿含量，且不同遮陰方式的增加效果不一樣，其中黑色雙層遮陽網(wǎng)遮蔭效果最好。而鄭高云等［45-46］研究也表明，植物為了預(yù)防蟲害，會釋放更多的咖啡堿。

同時，咖啡堿在植物體內(nèi)的分解也影響咖啡堿在植物體內(nèi)的含量?？Х葔A在植物體內(nèi)的代謝，一方面是合成，一方面是分解?？Х葔A的分解先脫去環(huán)上的基團(tuán)，變成黃嘌呤，脫下的甲基又通過四氫葉酸載體轉(zhuǎn)移到其他化合物中［32］，黃嘌呤有兩種去向，一種是繼續(xù)分解，一種是轉(zhuǎn)化為其它嘌呤核苷酸再被利用。黃嘌呤在茶樹體內(nèi)的分解主要是在老葉中進(jìn)行，分解產(chǎn)物主要是尿酸和尿囊素。研究報道，夏季高溫加速蛋白質(zhì)以及咖啡堿的分解［34］，導(dǎo)致植物體內(nèi)的咖啡堿含量降低。

4 結(jié)論

咖啡堿在幼齡組織中的合成量顯著高于成熟組織中的合成量；合成途徑中的CaXMT1、CaDXMT1、CCS13個關(guān)鍵酶基因，在不同組織不同發(fā)育時期表達(dá)具有差異性。