天津市河西區(qū)疾病預(yù)防控制中心（300211）高揚(yáng) 尹嘯冰

天津醫(yī)院（300211）王彤

隨著人們生活水平和健康意識的不斷提高，食品安全逐漸得到關(guān)注，食源性病原菌為導(dǎo)致食品健康的關(guān)鍵問題，目前也引起醫(yī)學(xué)界的高度重視[1]，加強(qiáng)食品安全監(jiān)控，越來越受到各國衛(wèi)生專家的重視。自1973年以來，關(guān)于食品安全中微生物的快速檢驗(yàn)國際研討會每3年舉辦一次。傳統(tǒng)致病菌檢測方法包括：生理檢測、生化檢測、血清水平檢測等，但傳統(tǒng)檢測方法檢測時(shí)間長、靈敏度低[2]。因此，應(yīng)尋找一種操作簡便、靈敏度高、檢測速度快的檢測方式，多重PCR檢測為目前臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。多重PCR反應(yīng)在相同反應(yīng)體系中加入多種基因引物，經(jīng)一次反應(yīng)擴(kuò)增多重目的基因，因反應(yīng)體系不同引物及基因組的相互干預(yù)，必須經(jīng)多重PCR體系優(yōu)化，測定腸道病原菌種類，為臨床診斷及治療提供重要依據(jù)。研究顯示[3]，多重PCR可快速、正確區(qū)分腸道致病菌，為臨床診斷提供重要依據(jù)。本文通過應(yīng)用PCR檢測4種致病菌，討論臨床檢測效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 蠟樣芽胞桿菌、普通變形桿菌和副溶血性弧菌來源于北京蘭博瑞公司，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌來源于疾病防控中心。試劑包括：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PCR試劑、血平板培養(yǎng)基、革蘭陰性增菌液培養(yǎng)基、溶菌肉湯培養(yǎng)基。儀器包括：離心機(jī)、梯度PCR儀、電泳儀、EC紫外成像系統(tǒng)。

1.2方法 ①菌株培養(yǎng)、DNA培養(yǎng)：應(yīng)用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)變形桿菌、大腸桿菌，置于37℃，可選擇3個(gè)～5個(gè)菌種，菌種接種至LB液體培養(yǎng)基，其他菌株采用相同培養(yǎng)方式，在DNA提取過程中保證正規(guī)提取?；蛐蛄幸锞唧w情況見附表。②引物設(shè)計(jì)及合成：4種細(xì)菌依照基因序列提取，篩選特異基因?yàn)榘行蛄校行蛄性O(shè)計(jì)引物。③單重PCR擴(kuò)增、多重PCR建立：上述細(xì)菌單獨(dú)擴(kuò)增，表現(xiàn)為反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為90℃條件下預(yù)變性2.5min，相同條件變性30s，在65℃條件下退火30s，在75℃延伸30s，共36個(gè)循環(huán)，在75℃條件下延伸10min。建立多重PCR在單重基礎(chǔ)完成，多2個(gè)循環(huán)，按照電泳亮度確定退火溫度。④多重PCR特異性檢測：將菌株置入相同反應(yīng)體系，同時(shí)加入對應(yīng)特異性引物，多重PCR擴(kuò)增。多重PCR靈敏性檢測，細(xì)菌培養(yǎng)24h后，取出懸液，梯度稀釋，按照1∶3∶2比例提取DNA，優(yōu)化后體系反應(yīng)。細(xì)菌檢測模擬果汁進(jìn)行，選擇多種樣式果汁，作為樣品，混合一定量的菌懸液，過夜培養(yǎng)，沉淀物取1ml，按照比例提取河段，進(jìn)行多種PCR檢測。菌株及來源均由疾病預(yù)防控制中心提供。儀器包括：DNA提取試劑盒、PCR試劑、血平板、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、梯度PCR儀器。

2 結(jié)果

多重PCR檢測效果顯著，可擴(kuò)大致病菌目的基因片段，表現(xiàn)特定結(jié)果形式。大腸桿菌擴(kuò)增片段357bp、普通變形桿菌片段518bp、副溶血性弧菌187bp、單核細(xì)胞增生李斯特菌片段165bp，特異性強(qiáng)，目標(biāo)菌檢測靈敏度為102FU/mL，可隨機(jī)接種其中3個(gè)細(xì)菌。

附表 基因序列引物

3 討論

本研究顯示，通過濃度、退火溫度以優(yōu)化PCR體系，正交實(shí)驗(yàn)把握各個(gè)組有效濃度和退火溫度，同時(shí)針對多種PCR檢測特異性，多體現(xiàn)在引物同模板匹配度，有效匹配是保證特異性的必要條件，同時(shí)在研究過程中，一次性加入不同菌群引物，擴(kuò)增細(xì)菌基因片段，可實(shí)現(xiàn)一次性檢測，充分體現(xiàn)檢測時(shí)效性，靈敏度及模擬果汁檢測方面，同文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果，基本一致。

總之，多重PCR可快速、正確區(qū)分大腸桿菌、普通變形桿菌、副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌4種腸道致病菌，具有準(zhǔn)確度高、檢測速度快、效率高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在保證檢測水平的同時(shí)，提高病原菌檢測效率，值得推廣應(yīng)用。