劉 剛，周志英，劉育辰?，張永萍，楊立勇，向興泉，林澤武

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng)550025；3.貴州特色制藥有限責(zé)任公司，貴州 貴定 551300）

在廣西，俗稱甜茶的植物有9 種，分布于7 科8 屬［12］，分別為甜茶、多穗柯、華腺萼木、黃杞、光葉耳草、牛白藤、顯齒蛇葡萄、子楝樹、甜葉菊，其中牛白藤具有清熱解毒功效［13］，黃杞具有清熱解毒、生津止渴、解暑利濕功效［14］，而甜茶最引人關(guān)注。目前，相關(guān)研究主要集中于化學(xué)成分、提取純化工藝、藥理活性等方面［15］，其所含成分的定性和定量鑒別主要集中于甜茶素［16］、根皮苷［17］、槲皮素和山奈酚［18］、齊墩果酸和熊果酸［19］等，而法定標(biāo)準(zhǔn)中《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（第二卷）只有性狀鑒別，《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003 版）只有性狀、薄層鑒別，尚未涉及金絲桃苷，而現(xiàn)代藥理研究表明它能抑制肺炎支原體肺炎模型小鼠損傷［20］，與甜茶潤(rùn)肺功效密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)建立甜茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其中金絲桃苷進(jìn)行定性、定量分析，為控制該藥材質(zhì)量提供研究思路，并為相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate-3000 高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；AR2140 電子天平（萬(wàn)分之一）、EX225DZH 電子天平（十萬(wàn)分之一）［奧豪斯儀器（常州）有限公司］；SB-5200DT 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Q-300B 高速多功能粉碎機(jī)（上海冰都電器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；WFH-203B 三用紫外分析儀（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；S1710111 MODEL5000-507 恒溫控制箱（天津譜祥科技有限公司）；DK-98-1 電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥 金絲桃苷（批號(hào)111521-201708）、蘆丁（批號(hào)100080-201610）對(duì)照品及甜茶對(duì)照藥材（批號(hào)121372-200401）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甜茶產(chǎn)地廣西，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王世清教授鑒定為薔薇科植物甜葉懸鉤子Rubus suavissimusS.Lee 的干燥葉，具體見表1。硅膠GF254薄層板（100 mm×100 mm，青島海洋化工廠分廠，批號(hào)20150603）。乙腈為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 定性鑒別 取藥材粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加70% 甲醇25 mL，超聲30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；取對(duì)照藥材粉末1.0 g，同法制成相應(yīng)溶液；取金絲桃苷、蘆丁對(duì)照品適量，70%甲醇制成每1 mL 各含0.1 mg 兩者的相應(yīng)溶液。按照2015 年版《中國(guó)藥典》四部通則0502，吸取上述溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以醋酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見圖1。由圖可知，供試品色譜中在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色熒光斑點(diǎn)。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

圖1 各成分TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of various constituents

2.2 常規(guī)檢查

2.2.1 水分 按照2015 版《中國(guó)藥典》四部通則0832 項(xiàng)下第二法（烘干法），測(cè)得10 批藥材含水量為7.35%～9.19%，平均值8.13%，見表2。

2.2.2 醇溶性浸出物 按照2015 版《中國(guó)藥典》四部通則2201 醇溶性浸出物項(xiàng)下熱浸法測(cè)定，以50%乙醇為溶劑，測(cè)得10 批藥材中醇溶性浸出物含有量為26.04%～45.11%，平均40.16%，見表2。

2.3 含有量測(cè)定

任何學(xué)生都有著自己獨(dú)一無(wú)二的不同成長(zhǎng)背景和生活環(huán)境，自然個(gè)性和愛好也不一樣。作為體育老師應(yīng)當(dāng)接受學(xué)生的這種差異性，并在充分尊重的基礎(chǔ)上來(lái)適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。讓學(xué)生可以自由選出自己喜歡的運(yùn)動(dòng)內(nèi)容，如此將有助于學(xué)生提高體育鍛煉的積極性，學(xué)生才會(huì)主動(dòng)起來(lái)。例如，當(dāng)進(jìn)行體育與健康課的室外活動(dòng)時(shí)，老師不妨使用自由學(xué)習(xí)的辦法，也就是由老師引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行相關(guān)的熱身運(yùn)動(dòng)以確保安全，再根據(jù)各個(gè)學(xué)生的不同情況進(jìn)行分組來(lái)做自由運(yùn)動(dòng)鍛煉，使學(xué)生可以增加體育運(yùn)動(dòng)熱情，逐漸養(yǎng)成終身鍛煉的習(xí)慣。這種教學(xué)方法可以進(jìn)行如下施行：

表2 水分、醇溶性浸出物、金絲桃苷含有量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of water，alcoholsoluble extract and hyperoside

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取金絲桃苷對(duì)照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇超聲溶解后定容，即得（1 mg／mL）。

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末約1 g，置于50 mL 具塞三角瓶中，25 mL 70%甲醇回流提取2 次，每次45 min，合并提取液，置于100 mL量瓶中，70% 甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2% 磷酸（B）（17∶83）；檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖2，可知金絲桃苷達(dá)到基線分離，并與其他組分分離度較好。

圖2 金絲桃苷HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of hyperoside

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取適量對(duì)照品溶液，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.2 mg／mL，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定2 次。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為Y=436.68X-0.2396 6（R2=0.999 9），在0.01～0.2 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得金絲桃苷峰面積RSD 為0.37%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批供試品溶液（批 號(hào)170927），于0、6、9、12、15、24 h 在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷峰面積RSD 為0.79%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材6 份（批號(hào)170927），按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷含有量RSD 為0.24%，表明該方法重復(fù)性好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的樣品0.5 g（批號(hào)170927），共6 份，加入對(duì)照品適量，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 金絲桃苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for hyperoside（n=6）

2.3.9 樣品含有量測(cè)定 取10 批藥材，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，每批平行2 次，計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 TLC 鑒別方法篩選 本研究考察了醋酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）、乙醇-甲酸（50∶1）、醋酸乙酯-乙醇-水-冰醋酸（10∶5∶1∶1）展開系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)醋酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）展開時(shí)樣品分離度最好，斑點(diǎn)清晰。同時(shí)，還考察了硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜對(duì)展開效果的影響，發(fā)現(xiàn)后者拖尾嚴(yán)重，而前者可見清晰斑點(diǎn)，分離效果較好，并且是實(shí)驗(yàn)室常用品。

3.2 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑種類（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、95%乙醇、70% 乙醇、50% 乙醇）、提取溶劑用量（15、25、50 倍）、提取方法（回流、超聲）、提取時(shí)間（30、45、60 min）、提取次數(shù)（1、2、3 次）等因素，最終確定供試品溶液制備方法為25 倍量70%甲醇回流提取2 次，每次45 min。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 由于金絲桃苷在255 nm 波長(zhǎng)處有較強(qiáng)的吸收，而且色譜峰對(duì)稱，干擾少，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 流動(dòng)相篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙 腈-0.2% 醋 酸、乙 腈-0.2% 磷 酸、乙 腈-0.2%甲酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2% 磷酸分離效果最好，故選擇其作為流動(dòng)相。

3.5 柱溫篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了30、35、38、40 ℃，發(fā)現(xiàn)35 ℃時(shí)色譜峰分離度、峰形最優(yōu)，故選擇其作為柱溫。

3.6 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)確定 按不高于平均量的20%制定標(biāo)準(zhǔn)，甜茶中含水量應(yīng)不得超過(guò)9.76%，但該藥材主產(chǎn)于廣西，空氣濕度大，本實(shí)驗(yàn)最終建議不得超過(guò)12.00%；按不低于最低值的80% 制定標(biāo)準(zhǔn)，甜茶中醇溶性浸出物含有量應(yīng)不得低于20.83%，本實(shí)驗(yàn)最終建議不得低于18.00%；10 批樣品材中金絲桃苷含有量范圍為0.51%～1.44%，不同產(chǎn)地、批次的差異比較大，其原因可能與采收時(shí)間、產(chǎn)地等因素有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)最終建議按干燥品計(jì)算不得低于0.30%。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次以金絲桃苷為指標(biāo)成分，建立了甜茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有利于該藥材臨床應(yīng)用的有效性和安全性，也可為其潤(rùn)肺功效的研究提供參考。