周 斌， 蘇學(xué)英， 左新華， 謝福源

(1鷹潭市人民醫(yī)院， 江西 鷹潭 335000； 2四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科， 四川 成都 610041； 3鷹潭市中醫(yī)院檢驗(yàn)科， 江西 鷹潭 335000； 4南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科， 江西 南昌 330006)

宮頸癌是臨床上最為常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)生率位居女性惡性腫瘤的第2位，僅次于乳腺癌，在一些發(fā)展中國(guó)家甚至已經(jīng)躍居于首位[1-2]。在我國(guó)，女性宮頸癌發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性朋友的生命健康[3]。大量臨床證據(jù)表明，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是大多數(shù)惡性腫瘤的主要始動(dòng)因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約有6.5%的惡性腫瘤患者與 HPV 感染有關(guān)，在與諸多惡性腫瘤感染相關(guān)的因素中占據(jù)首位[4]。研究揭示，HPV 感染是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生的必要條件，分子流行病調(diào)查已發(fā)現(xiàn)宮頸癌標(biāo)本中高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)DNA 陽(yáng)性率達(dá)到了99.8%[5-7]。目前臨床上針對(duì)HPV 感染的預(yù)防已升級(jí)為宮頸癌預(yù)防的二級(jí)措施。研究表明，HPV L1殼蛋白(capsid protein)是HPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由晚期轉(zhuǎn)錄基因L1編碼，在所有類型的HPV中高度保守，約占衣殼蛋白的90%以上[8-9]。此外，HPV L1殼蛋白是公認(rèn)的機(jī)體免疫監(jiān)控識(shí)別位點(diǎn)以及細(xì)胞免疫殺傷HPV的攻擊位點(diǎn)。本研究旨在通過探討HPV L1殼蛋白表達(dá)對(duì)機(jī)體免疫因子以及免疫細(xì)胞群體的影響，為進(jìn)一步闡釋HPV L1殼蛋白表達(dá)的檢測(cè)對(duì)于宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化以及機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)判斷的臨床價(jià)值，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

ThinPrep 2000自動(dòng)制片系統(tǒng)處理制成薄層涂片(用于婦科宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè))及Cervista HPV 檢測(cè)系統(tǒng)(用于宮頸細(xì)胞高危型人乳頭瘤病毒檢測(cè))均購(gòu)自HOLOGIC。賽泰?細(xì)胞/組織人乳頭瘤病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HPV L1殼蛋白(ADVANCED)；流式細(xì)胞儀(Beckman)用于免疫細(xì)胞群體(效應(yīng)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)的檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD；白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的ELISA試劑盒(BD)。

2 調(diào)查對(duì)象

鷹潭市人民醫(yī)院2012年7月～2014年12月期間在婦科門診就診婦女280例，年齡22～68歲，平均(38.12±9.48)歲。280例納入研究者參考國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)推薦的TBS(2001)分類標(biāo)準(zhǔn)包括5類：上皮內(nèi)病變陰性(negative intraepithelial lesion，NILM)型179例，非典型性鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cell，ASC)型41例、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LISL)型30例、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)型28例和鱗狀上皮癌(squamous-cell carcinoma，SCC)型2例。納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)所有患者均符合《〈婦產(chǎn)科抗生素使用指南〉解讀》[10]中有關(guān)于人宮頸乳頭瘤病毒的臨床感染診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)所有患者均已有性生活史；(3)均無(wú)宮頸錐切、子宮切除及宮頸手術(shù)史；(4)患者無(wú)放化療史；(5)研究均經(jīng)患者及其家屬知情同意，并簽署知情同意書，亦均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)正處于哺乳期以及妊娠期的女性；(2)合并有嚴(yán)重的滴蟲性、霉菌性陰道炎的患者；(3)合并有心腦血管疾病以及肝腎功能不全的患者；(4)有嚴(yán)重精神疾病無(wú)法配合研究的患者。

3 方法

3.1標(biāo)本收集 檢查前 72 h，受檢者禁止性生活及陰道沖洗，用窺陰器暴露宮頸后，使用棉球輕輕擦去宮頸穹窿與表面的分泌物，將專用薄層液基細(xì)胞學(xué)子宮頸刷頭緩緩導(dǎo)入子宮頸管內(nèi)，于子宮頸外口鱗柱狀上皮交界處，以子宮頸外口為中心，順時(shí)針均勻旋轉(zhuǎn)7周以后取出，將宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本置于專用液基細(xì)胞保存瓶送檢。

3.2陰道鏡下活檢及病理 受檢者均行陰道鏡檢查，消毒外陰、陰道和宮頸后，無(wú)明顯異常者則于陰道鏡下使用活檢鉗采取3、6、9和12點(diǎn)活檢+宮頸搔刮，對(duì)可疑病灶進(jìn)行定位活檢+宮頸搔刮，組織先行固定后，經(jīng)病理師切片、染色后, 由2位資深病理學(xué)專家在雙盲下進(jìn)行閱片。根據(jù)WHO 2014 年版國(guó)際疾病分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)診斷。

3.3液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(liquid-based cytology test，TCT) 將細(xì)胞保存液中的細(xì)胞從刷子上沖洗下來(lái)，隨后的制片及染色均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。采用2001年描述性宮頸細(xì)胞學(xué)診斷報(bào)告方式TBS(The Bethesds System)報(bào)告系統(tǒng)，細(xì)胞學(xué)結(jié)果判定：陰性為正常細(xì)胞以及組織細(xì)胞的良性改變，即NILM；陽(yáng)性為各種程度的鱗狀上皮細(xì)胞異常，包括ASC陽(yáng)性、LSIL陽(yáng)性、HSIL陽(yáng)性和SCC陽(yáng)性。

3.4HPV L1殼蛋白的檢測(cè) 將細(xì)胞保存液中的細(xì)胞從刷子上沖洗下來(lái)后，應(yīng)用賽泰?細(xì)胞/組織人乳頭瘤病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HPV L1殼蛋白，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。HPV L1殼蛋白表達(dá)陽(yáng)性的診斷以顯微鏡下閱片有1個(gè)細(xì)胞核被染紅即可，計(jì)算HPV L1殼蛋白陽(yáng)性率。

3.5ELISA檢測(cè)血清中IL-2和TNF-α水平 所有受檢者均采集清晨空腹靜脈血5 mL，離心后留取血清，于-20℃條件保存，檢測(cè)采用ELISA檢測(cè)患者血清IL-2以及TNF-α水平。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。

3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血液中免疫細(xì)胞亞群的變化 采集受檢者血液樣本，離心并收集細(xì)胞，采用PBS洗滌液洗滌后，用流式細(xì)胞術(shù)按照標(biāo)準(zhǔn)程序檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活化T細(xì)胞(CD3+CD25+)、NK細(xì)胞(CD3-CD16-CD56+)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+FoxP3+)亞群的變化情況。所有操作均按照試劑盒操作說(shuō)明書嚴(yán)格執(zhí)行。

3.7Cervista HPV的檢測(cè) 標(biāo)本取自于TCT檢測(cè)用的同一標(biāo)本的同一份細(xì)胞保存液，所有HR-HPV DNA檢測(cè)按照生產(chǎn)商的說(shuō)明在Cervista技術(shù)平臺(tái)中進(jìn)行。Cervista HPV-DNA檢測(cè)方法將HR-HPV陽(yáng)性結(jié)果分為3個(gè)組，分別為A5/A6型組(包括HPV51、56和66亞型)，A7型組(包括HPV 18、39、45、59和68亞型)和A9型組(包括HPV16、31、33、35、52和58亞型)，任意一組陽(yáng)性即判定HR-HPV DNA結(jié)果陽(yáng)性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間經(jīng)t檢驗(yàn)比較；計(jì)數(shù)資料采用百分位數(shù)表示，組間經(jīng)2檢驗(yàn)對(duì)比分析；樣本數(shù)據(jù)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析法進(jìn)行檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TCT檢測(cè)結(jié)果和受檢者HR-HPV陽(yáng)性分布情況

280例患者中，TCT檢測(cè)結(jié)果顯示，NILM、ASC、LSIL、HSIL和SCC 5種類型的人數(shù)分別為179例、41例、30例、28例和2例。隨著TCT級(jí)別的升高，HR-HPV陽(yáng)性率明顯升高，在SCC中，HR-HPV陽(yáng)性率達(dá)到100%，見表1。

表1 TCT檢測(cè)的5種類型宮頸細(xì)胞HR-HPV和HPV L1殼蛋白陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)結(jié)果比較

**P<0.01vsnegative.

2 不同分型中HPV L1殼蛋白的陽(yáng)性表達(dá)

按照TCT細(xì)胞分級(jí)，280例受檢者中HPV L1殼蛋白表達(dá)陽(yáng)性在NILM組中占39.66%(71/179),在ASC組中占41.46%(17/41),在LSIL組中占73.33%(22/30),在HSIL組中占32.14%(9/28),在SCC組中陽(yáng)性率為0%，各組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。按照病理活檢分型，在280例受檢者中HPV L1殼蛋白表達(dá)陽(yáng)性119例(總陽(yáng)性率74.14%)，其中CIN I占64.71%(33/51)，CINⅡ/Ⅲ占31.03%(9/21)，兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，2例SCC患者的HPV L1殼蛋白表達(dá)均為陰性。即組織病理學(xué)病變程度越重，則HPV L1殼蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率越低，見表1。

3 不同HPV L1殼蛋白表達(dá)患者的血清IL-2和TNF-α水平比較

HPV L1殼蛋白表達(dá)陽(yáng)性的受檢者中，血清IL-2水平為(3.20±0.70) ng/L，顯著低于HPV L1殼蛋白表達(dá)陰性受檢者的(5.42±0.72)ng/L(P<0.01)。HPV L1殼蛋白表達(dá)陽(yáng)性的受檢者中，TNF-α水平為(14.10±1.25) ng/L，明顯高于HPV L1殼蛋白表達(dá)陰性的受檢者(P<0.01)，見表2。

表2 不同HPV L1殼蛋白表達(dá)患者的血清IL-2和TNF-α水平比較

**P<0.01vsnegative.

4 不同HPV L1殼蛋白表達(dá)的患者血液中各免疫細(xì)胞亞群的分布

在HPV L1殼蛋白表達(dá)陽(yáng)性的受檢者血液中，免疫激活型細(xì)胞亞群活化T細(xì)胞以及NK細(xì)胞數(shù)明顯高于HPV L1殼蛋白表達(dá)陰性的受檢者(P<0.01)；而HPV L1殼蛋白表達(dá)陽(yáng)性的受檢者血液中免疫抑制性細(xì)胞亞群Treg細(xì)胞顯著低于HPV L1殼蛋白表達(dá)陰性的受檢者(P<0.01)，見表2。

5 HPV L1殼蛋白陽(yáng)性表達(dá)與免疫細(xì)胞亞群分布的相關(guān)性分析

相關(guān)分析結(jié)果可見，HPV L1殼蛋白陽(yáng)性表達(dá)與免疫激活細(xì)胞亞群分布具有正相關(guān)性，而與免疫抑制性細(xì)胞亞群分布呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

宮頸癌是臨床婦科中最為常見的惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)宮頸癌發(fā)病病例約有50萬(wàn)例[1,11]，而在我國(guó)，這一數(shù)字高達(dá)14萬(wàn)例，對(duì)廣大婦女朋友的生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。早期診斷對(duì)宮頸癌的治療極其重要，目前臨床上對(duì)于宮頸癌的診斷主要依據(jù)其明顯的臨床癥狀，然而，由于其癥狀出現(xiàn)較晚，導(dǎo)致宮頸癌的早期診斷及后期治療受到極大阻礙[12]。

HPV感染與女性生殖道疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13]。研究表明一半以上的宮頸癌與持續(xù)慢性的 HPV 感染密切相關(guān)[14-16]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年大約有6億女性感染HPV，但其中絕大部分感染者(約90%)均能夠通過自身的免疫系統(tǒng)自愈，因此，免疫系統(tǒng)功能的正常對(duì) HPV病毒的清除尤為重要。

HPV L1殼蛋白是一種由晚期轉(zhuǎn)錄基因L1編碼的在所有類型的HPV中高度保守的蛋白，其含量約占到衣殼蛋白的90%以上，是學(xué)界公認(rèn)的免疫反應(yīng)攻擊HPV病毒和病毒感染宿主細(xì)胞的主要靶位，也是HPV 疫苗形成的重要前提[17]。有研究顯示，HPV L1殼蛋白表達(dá)強(qiáng)弱與患者宮頸損傷程度密切相關(guān)[18]。通常情況下，在HPV感染的早期階段，即病毒復(fù)制階段，HPV L1殼蛋白的表達(dá)增加；在HPV感染的晚期階段，即病毒感染轉(zhuǎn)化階段，HPV L1殼蛋白的表達(dá)被抑制，直至缺失[19]。究其原因，是由于 HPV 此時(shí)已經(jīng)整合到宿主基因內(nèi)，從而導(dǎo)致HPV L1殼蛋白的產(chǎn)生減少[20]。

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多階段的連續(xù)性過程，受機(jī)體內(nèi)外環(huán)境因素的影響。腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征之一[21]。研究表明，惡性腫瘤患者往往伴隨機(jī)體免疫功能下降，從而導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法有效清除惡性增殖的突變細(xì)胞，出現(xiàn)免疫逃逸[22]。研究揭示，HPV L1殼蛋白單體能夠通過與I/II類MHC和T細(xì)胞(CD4/CD8)形成免疫復(fù)合物，從而將免疫連鎖反應(yīng)迅速激活，促進(jìn)高濃度的免疫抗體產(chǎn)生，從而達(dá)到免疫清除作用[23]。眾所周知，機(jī)體的免疫反應(yīng)由多個(gè)系統(tǒng)構(gòu)成，其中血清內(nèi)各類免疫因子(IL-2、TNF-α、IL-8、IL-10、INF-γ等)是免疫功能調(diào)控的重要參與者，此外，機(jī)體的相關(guān)免疫細(xì)胞的增殖活化情況同樣是反應(yīng)機(jī)體免疫狀態(tài)的重要參數(shù)。IL-2由Th1細(xì)胞分泌，可以介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞則參與體液免疫應(yīng)答，與Th1相互制約，維持動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)Th1向Th2偏移時(shí)，機(jī)體的免疫功能下降，會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。TNF-α由單核-巨噬細(xì)胞分泌，不僅具有選擇性殺傷某些腫瘤細(xì)胞的作用，還可參與免疫調(diào)控、感染、炎癥反應(yīng)等，可作為疾病療效以及預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。因此，IL-2與TNF-α均在宮頸HPV感染的發(fā)生過程中起到一定的作用。

本研究旨在探討HPV L1殼蛋白表達(dá)的情況，與宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)系，以及對(duì)于機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的影響，為闡明宮頸癌HPV L1殼蛋白表達(dá)與腫瘤免疫功能之間的關(guān)系，以期為確定其臨床應(yīng)用價(jià)值提供一定理論基礎(chǔ)。結(jié)果顯示HPV L1殼蛋白表達(dá)陽(yáng)性率隨著宮頸活檢確定的宮頸病變級(jí)別的加重而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并在SCC時(shí)表達(dá)為0，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； IL-2水平隨著HPV L1殼蛋白表達(dá)陽(yáng)性率升高而減少，TNF-α水平隨著HPV L1殼蛋白表達(dá)陽(yáng)性率升高而增加，經(jīng)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； HPV L1殼蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的降低伴隨著免疫激活性免疫細(xì)胞群體的增加以及免疫抑制性免疫細(xì)胞群體的減少，且二者具有相關(guān)性，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與已有研究成果相比，本研究不同之處在于利用相關(guān)性分析法對(duì)HPV L1殼蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與免疫細(xì)胞亞群之間的關(guān)聯(lián)性展開了分析，結(jié)果表明其陽(yáng)性表達(dá)與免疫激活細(xì)胞亞群分布具有正相關(guān)性，而與免疫抑制性細(xì)胞亞群分布呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。此點(diǎn)內(nèi)容在既有成果中并未見到，不失為本研究的創(chuàng)新之所在。

綜上所述，檢測(cè)子宮頸細(xì)胞HPV L1 殼蛋白表達(dá)對(duì)于判斷宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，確定機(jī)體免疫狀態(tài)，闡明宮頸癌發(fā)生的免疫機(jī)制，具有重要的臨床意義，值得進(jìn)一步深入研究和探討。