竇 艷, 邱 鵬, 陳江偉

(1邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科， 2邢臺(tái)市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科， 河北 邢臺(tái) 054000)

乳腺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前其發(fā)病率居世界第1位，死亡率居世界第5位[1]，是女性死亡的首要原因。近年來(lái)，雖然手術(shù)治療聯(lián)合新的放療、化療等手段已大大提高了早期乳腺癌患者的生存率，但晚期患者的臨床生存率仍不容樂(lè)觀[2]。分子靶向藥物被認(rèn)為是乳腺癌治療的新途徑[3]，但仍有部分患者的分子分型難以匹配分子靶點(diǎn)。因此，進(jìn)一步闡明乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)提高乳腺癌的療效和改善患者的預(yù)后具有重要的作用。

微小RNA(microRNA, miRNA，miR)是一種非編碼單鏈RNA分子，參與調(diào)控靶基因的翻譯過(guò)程，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。miR-200家族是一種上皮細(xì)胞標(biāo)志物，是參與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的主要調(diào)節(jié)分子[4]，其基因被認(rèn)為是一種抑癌基因。然而，綜合目前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-200家族成員在不同腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮的作用并不完全相同。 miR-200家族在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)，在鼻咽癌細(xì)胞系中內(nèi)源性miR-200a的表達(dá)隨細(xì)胞分化程度的增加而增加[5]。在腎癌中miR-200a可以靶向β-catenin，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)的近端腎小管的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]。在缺乏甲基飲食誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型中miR-200b的表達(dá)也表現(xiàn)為下調(diào)[7]，而在相對(duì)于正常的黑色素細(xì)胞中miR-200家族的表達(dá)則是增加的[8]，但增加miR-200家族的表達(dá)水平并不能抑制黑色素瘤細(xì)胞的侵襲，而只是引起癌細(xì)胞侵襲方式的改變。miR-200c表達(dá)高的胰腺癌患者預(yù)后指標(biāo)更好，但增加胰腺癌細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)雖能抑制胰腺癌的侵襲，卻會(huì)增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的增殖能力[9]。這說(shuō)明miR-200家族成員在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用并不一致。miR-200a是miR-200家族的成員，其在乳腺癌中的表達(dá)水平發(fā)生改變會(huì)發(fā)揮怎樣的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)篩選了乳腺癌細(xì)胞系中miR-200a的表達(dá)情況，構(gòu)建了miR-200a 的模擬物(mimic)及抑制劑(inhibitor)，并轉(zhuǎn)染作用于乳腺癌細(xì)胞，探討其對(duì)乳腺癌惡性生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制，為乳腺癌的靶向治療提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；人乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A購(gòu)自上海豐壽生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PVDF膜和ECL發(fā)光液購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司；凋亡試劑盒和Transwell 試劑盒購(gòu)自Corning； TRIzol RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Qiagen；miRNA熒光定量PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄引物購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；miR-200a mimic 和inhibitor購(gòu)自上海吉瑪生物；Western抗體購(gòu)自Proteintech；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine? 2000購(gòu)自Invitrogen；CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁生物。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇乳腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，密度達(dá)到80%時(shí)開(kāi)始傳代。應(yīng)用Lipo fectamine 2000轉(zhuǎn)染，參照說(shuō)明書進(jìn)行，用不含有抗生素含血清的DMEM培養(yǎng)液重懸乳腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于37 ℃、5%CO2孵箱中過(guò)夜。轉(zhuǎn)染前24 h 細(xì)胞接種至6 孔板中，密度為1×105，采用含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到50%～80%。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照riboFECTTM CP 轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)組：陰性對(duì)照(miR-negative control, miR-NC)組，加入陰性對(duì)照mimic及riboFectTMCP 試劑；模擬物(miR-mimic)組，加入miR-200a mimics及riboFectTMCP 試劑；抑制劑(miR-inhibitor)組，加入miR-200a 抑制劑及riboFectTMCP 試劑。之后將6 孔板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。然后更換新鮮的含10%新生牛血清的DMEM全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后可直接收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力, 按照試劑盒說(shuō)明書操作。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以3×106/L的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加100 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 h，行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的96孔板置于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。后續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后分別加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀上機(jī)檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度(A)值，計(jì)算每組細(xì)胞增殖能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證3次。

2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理48 h后，收集培養(yǎng)液上清，PBS清洗細(xì)胞2次，加入2 mL 0.25%不含EDTA的胰酶消化液處理細(xì)胞，顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓并脫離培養(yǎng)皿底部時(shí)，加入3 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，輕柔吹打分散細(xì)胞團(tuán)；將含有細(xì)胞的混合液全部取到15 mL無(wú)菌離心管中，600×g離心5 min，棄掉上清，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，避光染色15 min，加入5 μL PI染液，室溫避光染色5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)lowJo軟件分析凋亡檢測(cè)結(jié)果。

2.4細(xì)胞侵襲檢測(cè) 無(wú)菌24孔板按實(shí)驗(yàn)需求放置Transwell小室，小室內(nèi)按1∶10比例鋪入80 μL基質(zhì)膠，將鋪好基質(zhì)膠的24孔板置于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中沉降4 h，小室外的孔中加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，小室內(nèi)按200 μL不含血清的細(xì)胞懸液中鋪入5×104轉(zhuǎn)染6 h后的細(xì)胞，24孔板置于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。48 h后取出小室，PBS清洗小室底部2次，用棉棒將小室內(nèi)面未穿透的細(xì)胞擦干凈，小室置于4%多聚甲醛中固定30 min，PBS洗凈固定液，結(jié)晶紫染液30 min，PBS清洗結(jié)晶紫2次，倒置晾干小室后在倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，比較各組細(xì)胞侵襲能力。

2.5Real-time PCR 檢測(cè)miR-200a以及EMT相關(guān)指標(biāo)mRNA的表達(dá)水平 TRIzol試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，用NanoDrop 2000測(cè)量各組RNA濃度將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

用兩步法染料試劑盒檢測(cè)SIP1、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Twist、ZEB1和ZEB2 mRNA的表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參照；用兩步探針?lè)ㄔ噭┖袡z測(cè)miR-200a的表達(dá)情況，以U6為內(nèi)參照。2-ΔΔCt法表示SIP1、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Twist、ZEB1、ZEB2和miR-200c的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)中所用到PCR引物見(jiàn)表1。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析: 95 ℃ 15 s, 65 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。采集信號(hào)進(jìn)行定量分析。

2.6Western blot 細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理48 h后抽提蛋白，采用BCA蛋白濃度定量試劑盒檢測(cè)蛋白樣品的濃度，計(jì)算上樣量。取適量的蛋白與5×蛋白上樣緩沖液混合(4∶1)，95 ℃金屬浴煮沸5 min蛋白變性。按照實(shí)驗(yàn)需求配置聚丙烯酰凝膠。蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃孵育Ⅰ抗過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入相應(yīng)Ⅱ抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜2次，ECL發(fā)光，照相，Scion Image軟件測(cè)灰度值定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用單因素方差分析 (one-way ANOVA) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-200a在乳腺細(xì)胞系中的表達(dá)情況

RT-qPCR結(jié)果顯示,與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比，miR-200a在MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中表達(dá)降低(P<0.05)，在MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)量最低，在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇MDA-MB-231作為miR-200a的轉(zhuǎn)染對(duì)象。轉(zhuǎn)染miR-200a mimic后，miR-200a在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，轉(zhuǎn)染miR-200a inhibitor后miR-200a在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2，說(shuō)明miR-200a序列設(shè)計(jì)有效。

表1 RT-qPCR引物序列

F: forward; R: reverse.

Figure 1. The relative expression of miR-200a in human normal breast epithelial cells and breast cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsMCF-10A cells.

圖1 正常乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中miR-200a的表達(dá)情況

Figure 2. The relative expression of miR-200a after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-NC group.

圖2 轉(zhuǎn)染處理后MDA-MB-231細(xì)胞中miR-200a的表達(dá)情況

2 轉(zhuǎn)染miR-200a對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞惡性表型的影響

轉(zhuǎn)染miR-200a mimic和inhibitor 組24 h后，與miR-NC組相比，細(xì)胞增殖活力無(wú)顯著差異(P>0.05)；轉(zhuǎn)染48和72 h后，miR-mimic組的細(xì)胞增殖活力顯著低于miR-NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。轉(zhuǎn)染24 h后，miR-mimic組MDA-MB-231細(xì)胞的早期凋亡率為(12.7±4.27)%，miR-NC組MDA-MB-231細(xì)胞的早期凋亡率為(4.61±4.07)%，miR-inhibitor 組MDA-MB-231細(xì)胞的早期凋亡率為(1.48±4.81)%，即miR-mimic組的細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01)，而miR-inhibitor組的細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 3. The viability of the MDA-MB-231 cells after miR-200a mimic or inhibitor transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖3 miR-200a轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞活力的改變情況

Figure 4. The apoptosis of MDA-MB-231 cells after miR-200a mimic or inhibitor transfection. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsmiR-NC group.

圖4 miR-200a轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的改變情況

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，miR-mimic組的跨膜細(xì)胞數(shù)較miR-NC組顯著減少(P<0.05)，miR-inhibitor 組的跨膜細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)，即miR-mimic組的細(xì)胞侵襲力能力顯著減弱，而miR-inhibitor組的細(xì)胞侵襲力顯著增加，見(jiàn)圖5。

Figure 5. The invasion ability of MDA-MB-231 cells after miR-200a mimic or inhibitor transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖5 miR-200a轉(zhuǎn)染處理后MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的改變情況

3 miR-200a表達(dá)改變對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞表型及EMT通路相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)的影響

RT-qPCR及Western blot結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，miR-mimic組SIP1、N-cadhe-rin、Snail、Twist、ZEB1和ZEB2的mRNA和蛋白水平上較陰性對(duì)照表達(dá)顯著下調(diào)，E-cadherin在mRNA和蛋白水平上較陰性對(duì)照表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；miR-inhibitor組SIP1、N-cadherin、Snail、Twist、ZEB1和ZEB2在mRNA和蛋白水平上較陰性對(duì)照表達(dá)顯著上調(diào)，E-cadherin在mRNA和蛋白水平上較陰性對(duì)照表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖6、7。

討 論

MicroRNA 是一類非編碼小分子RNA，可通過(guò)堿基互補(bǔ)的方式與靶分子mRNA特異性結(jié)合，影響mRNA的降解和翻譯，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、生物體發(fā)育時(shí)序等生命過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[10]。miR-200家族是上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，是EMT的主要調(diào)節(jié)分子之一，在多種腫瘤和正常組織間存在差異表達(dá)，其基因可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-9, 11-12]。然而，同一種miR-200家族分子在不同腫瘤中表現(xiàn)出不同的作用。在胰腺癌中miR-200a呈低表達(dá)，在癌旁正常組織中呈高表達(dá)，高表達(dá)miR-200a的胰腺癌患者預(yù)后更好，但miR-200a高表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞的增殖能力更強(qiáng)。在黑色素瘤細(xì)胞中，miR-200c高表達(dá)導(dǎo)致較高比例的細(xì)胞以圓形“阿米巴樣”的方式侵襲，而miR-200a高表達(dá)使細(xì)胞以拉長(zhǎng)“間質(zhì)型”方式侵襲。研究證實(shí)，miR-200a能通過(guò)促進(jìn)PTEN的表達(dá)，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的胰腺形狀細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的形成，并抑制AKT和mTOR的磷酸化[13]。miR-200a和miR-200b可靶向抑制PTEN的表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外增殖[14]。這些研究表明，miR-200家族的功能在不同類型的腫瘤或細(xì)胞中有很大的異質(zhì)性，其不同亞型在乳腺癌中的具體作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本項(xiàng)工作顯示，在乳腺癌中，miR-200a的過(guò)表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖及侵襲，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，提示miR-200a在乳腺癌中可發(fā)揮抑制乳腺癌惡性生物學(xué)行為的抑癌作用。

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移由腫瘤細(xì)胞與其存在的微環(huán)境相互作用而產(chǎn)生，其中EMT是腫瘤進(jìn)展和腫瘤惡性表型轉(zhuǎn)化的首要跡象[15]。EMT可使上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞失去正常極性，失去與基底膜的連接，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞樣特性和較高遷移與侵襲能力，甚至獲得耐藥性[16-17]。新近研究表明，miRNA和EMT之間關(guān)系密切，過(guò)表達(dá)miR-186可抑制E-cadherin的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲[18]。在前列腺癌細(xì)胞中，miRNA-29b的高表達(dá)可以通過(guò)靶向Snail分子，逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程，抑制細(xì)胞的浸潤(rùn)表型[19]。miR-200a一方面通過(guò)靶向ZEB1/ZEB2，調(diào)節(jié)cadherin復(fù)合體，從而影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，另一方面直接抑制β-catenin的表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)β-catenin分布改變，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，抑制胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)表型[20]。研究證實(shí)[21]，Snail、Slug、ZEB1、ZEB2以及SIP1 等轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合在 E-cadherin基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域，通過(guò)降低 E-cadherin表達(dá)促進(jìn)EMT的發(fā)生，且這類轉(zhuǎn)錄因子還可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi) ERK、NF-κB和 PI3K 等信號(hào)通路的傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為。本項(xiàng)工作顯示，在乳腺癌中miR-200a 表達(dá)增加，癌細(xì)胞中SIP1、N-cadherin、Snail、Twist、ZEB1和ZEB2在mRNA和蛋白水平上較陰性對(duì)照均發(fā)生表達(dá)下調(diào)，E-cadherin在mRNA和蛋白水平上表達(dá)顯著上調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitor后上述結(jié)果被逆轉(zhuǎn)，這表明miR-200a在乳腺癌中可抑制EMT進(jìn)程，而miR-200a 表達(dá)增加乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為被抑制可能是通過(guò)抑制EMT的進(jìn)程來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

Figure 6. The changes of the mRNA expression in MDA-MB-231 cells after miR-200a mimic or inhibitor transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-NC group.

圖6 miR-200a轉(zhuǎn)染處理后MDA-MB-231細(xì)胞mRNA表達(dá)的改變情況

Figure 7. The changes of the proteins related to EMT signaling pathway in MDA-MB-231 cells after miR-200a mimic or inhibitor transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-NC group.

圖7 miR-200a轉(zhuǎn)染處理后MDA-MB-231細(xì)胞EMT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的改變情況

總之，我們通過(guò)體外研究證實(shí)，miR-200a可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，侵襲，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，其可能機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的EMT來(lái)實(shí)現(xiàn)的，miR-200a可作為乳腺癌患者潛在的生物治療靶點(diǎn)。但是miR-200a對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT表型的靶向調(diào)控方式，miR-200a表達(dá)改變對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)信號(hào)通路的影響，miR-200a表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系等尚不清楚，有待深入研究。