費雲(yún)昊， 陰 釗， 豐茂曉， 劉燕君， 費 嘉

(暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 廣東 廣州 510632)

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)是一種造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征表現(xiàn)為骨髓中的髓細(xì)胞不受調(diào)控地快速增殖，增殖的髓細(xì)胞在血液中積累[1]。費城染色體(Philadelphia chromosome, Ph)是CML的重要遺傳標(biāo)記，其來源于9號染色體上的ABL基因和22號染色體上的BCR基因相互融合[2]。22號染色體上的BCR基因在特定的斷裂位點上斷裂，與9號染色體上的ABL基因連接在一起，融合基因表達(dá)產(chǎn)生了BCR-ABL融合蛋白，具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，可以激活一系列腫瘤相關(guān)信號通路。因此目前針對CML的治療都集中在BCR-ABL蛋白抑制劑的開發(fā)。

小檗堿(berberine)又稱黃連素，是中藥黃連的主要活性成分，是一種穩(wěn)定存在的生物堿，廣泛存在于如小檗科、毛莨科等多種植物當(dāng)中，并易于獲得[3]。許多研究證據(jù)表明鹽酸小檗堿對痢疾桿菌、大腸桿菌和肺炎雙球菌等多種細(xì)菌有抑制作用[4]。近來研究顯示小檗堿在糖尿病[5]、降血脂治療[6]、阿爾茨海默病[7]以及抗腫瘤[8]等方面具有很好的應(yīng)用前景。小檗堿在血液系統(tǒng)腫瘤，如急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)中表現(xiàn)出強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性[9]。小檗堿能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，例如出現(xiàn)DNA規(guī)律性斷裂，電泳呈現(xiàn)凋亡的典型條帶變化。小檗堿還可以調(diào)控多種凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Bad的表達(dá)；下調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的水平[10]。小檗堿對CML細(xì)胞的研究已經(jīng)有了一定的進(jìn)展，但是小檗堿在CML中的靶標(biāo)及其相關(guān)機(jī)制尚無報道。

中藥是我國具特色和原創(chuàng)思想的物質(zhì)財富。然而，長期以來中藥研究只注重臨床實踐，而缺乏循證醫(yī)學(xué)的直接實驗證據(jù)，特別是藥效物質(zhì)和作用靶點不明確，因而難以深入揭示其治療疾病的分子機(jī)理，嚴(yán)重制約了中藥現(xiàn)代化和國際化。小檗堿是傳統(tǒng)治療痢疾桿菌的中藥，在民間應(yīng)用于治療多種疾病，雖然療效明確，但是其藥理機(jī)制和分子靶點均不清楚。

為了解小檗堿在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中的作用，本項工作鑒定了小檗堿在CML中的靶標(biāo)就是CML的特征性蛋白BCR-ABL，探討了小檗堿作用于BCR-ABL后對BCR-ABL蛋白表達(dá)量的影響，以及小檗堿降解BCR-ABL蛋白的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

人ABL1質(zhì)粒合成于廣州復(fù)能基因有限公司。小檗堿購自Sigma；BCR I抗購自Abcam;ABL1 I抗購自CST;GAPDH I抗購自CST；泛素化抗體[Anti-ubiquitin (FK2) antibody]購自Millipore；Protein A/G購自Santa Cruze。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) BaF3-P210和BaF3-P210-T315I細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗系臨床血液學(xué)教研室馮文莉教授惠贈。BaF3-P210細(xì)胞中含有P210 BCR-ABL蛋白，是一種慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系的模型。BaF3-P210-T315細(xì)胞是一種BCR-ABL-T315I突變引起耐伊馬替尼的細(xì)胞模型。293T-flag-BCR-ABL細(xì)胞是在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染flag-BCR-ABL質(zhì)粒構(gòu)建的過表達(dá)BCR-ABL蛋白的細(xì)胞。

2.2分子模擬對接實驗 從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中獲得ABL1蛋白三維空間結(jié)構(gòu)的PDB文件，包含：BCR-ABL蛋白 Protein Kinase區(qū)域(2ZQOH)；BCR-ABL蛋白(743 aa～1 028 aa)突變后的Protein Kinase區(qū)域(3IK3)； BCR-ABL蛋白SH2結(jié)構(gòu)域(635 aa～746 aa，3K2M)。在藥物數(shù)據(jù)庫中獲得小檗堿的三維空間結(jié)構(gòu)PDB文件。從Discovery的官網(wǎng)上下載Dicovery Studio 4.5軟件。將小檗堿和ABL1蛋白結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入進(jìn)入軟件中，使用受體-配體結(jié)合模塊，觀察小檗堿與ABL1蛋白SH3-SH2、PTK和F-actin 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合情況。

2.3蛋白表達(dá)及純化實驗 將1 μL ABL1結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒(SH3-SH2、PTK和F-actin)轉(zhuǎn)化到Arctic Expression (DE3) 感受態(tài)細(xì)菌中，次日早晨挑取平板上的單克隆接種于含 50 mg/L 卡那霉素的4 mL LB 培養(yǎng)液的試管中， 37 ℃、220 r/min 振搖培養(yǎng)至下午13點，OD約0.6；按1 ∶250 比例，接種于含50 mg/L 卡那霉素的1 L LB 培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min 振搖至菌體 OD 600 為 0.5～0.6 (約 3 h)；按照比例1 L 發(fā)酵培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑 IPTG 至終濃度為 0.1 mmol/L，220 r/min 16 ℃培養(yǎng)過夜； 5 000×g，5 min離心去上清收集發(fā)酵菌體，-20 ℃保存待破碎純化。

超聲破碎菌體破碎條件：350 W 功率，破碎 4 s，間隔 6 s，共 180 循環(huán)，破菌緩沖液：20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.0。 Ni-IMAC(5 mL) 純化破碎后的菌體 12 000×g，離心20 min， 4 ℃，收集上清進(jìn)行鎳柱純化，填料類型為 Ni-IMAC。平衡液配方為：20 mmol/L Tris, 500 mmol/L NaCl, pH 8.0，洗脫液：20 mmol/L Tris, 500 mmol/L NaCl, 500 mmol/L imidazole, pH 8.0。分別使用含有 20 mmol/L、50 mmol/L、200 mmol/L和500 mmol/L imidazole 的4種洗脫液進(jìn)行洗脫，根據(jù)吸收峰值收集洗脫液，蛋白純化出來后，進(jìn)行表面等離子體共振成像(surface plasma resonance imaging,SPRi)實驗。

2.4SPRi實驗 將鹽酸小檗堿點樣在3D光交聯(lián)芯片上，作為抗原，使用雷帕霉素作為芯片的陽性對照，將純化出的蛋白作為流動相，進(jìn)行流通，流通緩沖液為1×PBS (pH=7.4)，將SH3-SH2設(shè)置250、500、1 000和2 000 nmol/L共4個濃度梯度進(jìn)行流通，PTK設(shè)置100、200、400和800 mmol/L共4個濃度梯度進(jìn)行流通，F(xiàn)-actin設(shè)置100、200、400和800 nmol/L進(jìn)行流通，流通物進(jìn)樣速度為2 μL/s，時間為300 s，反應(yīng)在25 ℃的條件下進(jìn)行，通過SPRi測定中藥單體小檗堿與SH3-SH2等蛋白的動力學(xué)參數(shù)，分析其結(jié)合情況。

2.5Western blot實驗 本實驗分組為5 μmol(之前的實驗結(jié)果得知)小檗堿處理CML細(xì)胞0、4、12和24 h(泛素化檢測時間梯度設(shè)置為0、6、12、24和48 h)。取對數(shù)生長期的 BaF3-P210和BaF3-P210-T315I 細(xì)胞，以1×108/ L 的密度接種于6孔板，每孔4 mL，加入5 μmol的小檗堿處理不同的時間，收獲細(xì)胞，PBS 洗滌 3 次，RIPA法提取蛋白，采用 BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度。加入loading buffer進(jìn)行蛋白變性。用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，80 V 30 min，120 V 1 h。蛋白分離后 300 mA，1 h 20 min 轉(zhuǎn)膜至 PVDF 膜上。室溫下 5% 脫脂奶粉封閉膜 1 h，用相應(yīng)的I抗 4 ℃孵育膜過夜，洗滌后換 HRP 標(biāo)記II抗室溫孵育 1 h。洗滌后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒在ALLIANCE超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，檢測細(xì)胞中BCR-ABL的變化，以及泛素化水平的改變。

2.6免疫沉淀實驗 本實驗分組為：5 μmol小檗堿處理CML細(xì)胞48 h組;10 μmol MG132處理細(xì)胞48 h組；10 μmol MG132預(yù)處理細(xì)胞4 h后，加入5 μmol小檗堿處理細(xì)胞48 h組。蛋白提取步驟同上，每組蛋白提取液中加入5 μL IgG抗體(IgG抗體的種屬與目的蛋白抗體的種屬一致)，同時每管加入30 μL Protein A/G。放在旋轉(zhuǎn)式搖床上，4 ℃搖勻30 min。搖勻結(jié)束后，將離心管放入低溫離心機(jī)中。溫度設(shè)為4 ℃，2 500×g離心5 min。收集上清到新的EP管中，每管再加入30 μL Protein A/G。放在旋轉(zhuǎn)式搖床上，4 ℃搖勻30 min。搖勻結(jié)束后，將離心管放入低溫離心機(jī)中。2 500×g離心5 min。收集上清到新的EP管中，使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒的說明書測定蛋白濃度。之后，每1 mg蛋白加入2 μL BCR抗體，放在旋轉(zhuǎn)式搖床上，4 ℃孵育過夜。第2天，每管中加入40 μL Protein A/G.。旋轉(zhuǎn)式搖床上，4 ℃孵育4 h。孵育結(jié)束后，放入低溫離心機(jī)中。溫度設(shè)為4 ℃，2 500×g離心5 min。去上清，每管加入1 mL的PBS洗滌Protein A/G，4 ℃、2 500×g離心5 min。重復(fù)3次。每管加入40 μL 1×上樣緩沖液，沸水中煮10 min。Western blot 上樣量為5 μL。Western blot實驗步驟同上。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理使用SPSS統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)分析各組數(shù)據(jù)間差異的顯著性，以P<0.05為有顯著差異。

結(jié) 果

1 分子模擬對接預(yù)測小檗堿和慢性粒細(xì)胞白血病特征性蛋白BCR-ABL直接結(jié)合

Discovery Studio 4.1軟件分子模擬對接結(jié)果顯示，小檗堿可以直接和BCR-ABL蛋白羧基末端(1 519～1 644 aa)的F-actin連接區(qū)域(1ZZP)模擬對接，見圖1A；BCR-ABL蛋白的Protein Kinase區(qū)域(2ZQOH)可以和小檗堿模擬對接，見圖1B；BCR-ABL蛋白(743～1 028 aa)突變后的Protein Kinase區(qū)域(3IK3)可以和小檗堿模擬對接，見圖1C； BCR-ABL蛋白SH2區(qū)域(635～746 aa，3K2M)也可以和小檗堿模擬對接，見圖1D。

2 SPRi驗證小檗堿可以直接和慢性粒細(xì)胞白血病特征性蛋白BCR-ABL結(jié)合

SPRi實驗結(jié)果顯示，小檗堿可以直接和ABL1的SH3-SH2、PTK及F-actin結(jié)構(gòu)域結(jié)合，見圖2。

3 小檗堿和BCR-ABL結(jié)合后會降解CML細(xì)胞內(nèi)的BCR-ABL蛋白

小檗堿處理BaF3-P210和BaF3-P210-T315I細(xì)胞后，檢測細(xì)胞中CML特征性蛋白BCR-ABL結(jié)果顯示，隨著5 μmol/L小檗堿處理時間的增加，相比于內(nèi)參照β-actin蛋白，BCR-ABL蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 小檗堿通過促進(jìn)BCR-ABL蛋白的泛素化水平降解BCR-ABL蛋白

小檗堿處理293T-flag-BCR-ABL細(xì)胞后檢測細(xì)胞中整體泛素化水平及BCR-ABL蛋白泛素化水平，結(jié)果顯示，隨著小檗堿處理時間增加，小檗堿促進(jìn)293T-flag-BCR-ABL細(xì)胞中整體的泛素化水平，見圖4A, 促進(jìn)293T-flag-BCR-ABL細(xì)胞中BCR-ABL蛋白的泛素化水平，見圖4B。

討 論

近年來傳統(tǒng)中藥單體小檗堿在白血病細(xì)胞中的藥理作用日益受到重視。有研究報道，小檗堿可以通過抑制周期蛋白B1，同時促進(jìn)Wee1蛋白的表達(dá)，引起白血病細(xì)胞的周期阻斷[11]。小檗堿在控制白血病細(xì)胞的侵襲和遷移的能中起到重要的作用[12]。小檗堿對白血病治療的研究已經(jīng)進(jìn)行了很久，但是小檗堿在白血病中的靶標(biāo)及其作用機(jī)制尚不清楚。

Figure 1. The molecular docking simulation of berberine with BCR-ABL. A: berberine bound with the F-actin (1ZZP) domain of BCR-ABL; B: berberine bound with the PTK (2ZQOH) domain of BCR-ABL; C: berberine bound with the PTK mutation (3IK3) domain of BCR-ABL; D: berberine bound with the SH2 (3K2M) domain of BCR-ABL.

圖1 小檗堿和BCR-ABL進(jìn)行分子模擬對接

慢性粒細(xì)胞白血病的患者經(jīng)過伊馬替尼治療后的復(fù)發(fā)，大多涉及到BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶區(qū)域的突變。突變的ABL激酶區(qū)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，對于伊馬替尼這種根據(jù)BCR-ABL激酶區(qū)域特定位點設(shè)計的藥物就無法結(jié)合到該區(qū)域，無法阻止激酶的活性，即產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致臨床治療失敗。有報道顯示，中藥砷類化合物(As2O3和As4S4)已經(jīng)用于治療慢性粒細(xì)胞白血病。先前研究發(fā)現(xiàn)，砷類化合物和伊馬替尼可以引起CML細(xì)胞的凋亡[13]。也有研究表明，砷類化合物可以與BCR-ABL蛋白泛素化位點結(jié)合，引起CML中BCR-ABL蛋白的泛素化降解途徑，而非僅僅是抑制BCR-ABL的活性，這為我們的研究提供了新的思路[12]。有研究報道，小檗堿同樣也引起K562細(xì)胞生長抑制，之前我們的研究也表明，小檗堿具有明顯的抗CML的作用，但是小檗堿究竟是通過何種機(jī)制來產(chǎn)生這種作用尚未見報道，BCR-ABL融合蛋白的ABL區(qū)域具有4個結(jié)構(gòu)域，分別是SH3、 SH2、 F-actin和PTK，這4個結(jié)構(gòu)域均已經(jīng)被解析，我們從Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫下載該結(jié)構(gòu)域，并使用Discovery Studio軟件進(jìn)行分子模擬對接，檢測到小檗堿在CML中的直接靶標(biāo)就是CML特征性蛋白BCR-ABL，我們對小檗堿作用后慢性粒細(xì)胞白血病特征性蛋白BCR-BAL進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)小檗堿可以降低BaF3-P210-T315I細(xì)胞和BaF3-P210細(xì)胞中BCR-ABL蛋白表達(dá)量。進(jìn)一步實驗觀察小檗堿與BCR-ABL蛋白的對接處序列中發(fā)現(xiàn)賴氨酸存在，提示泛素化位點的存在。因此我們檢測了小檗堿作用后細(xì)胞中的泛素化水平并通過免疫沉淀的方法檢測了小檗堿作用前后細(xì)胞中BCR-ABL蛋白的泛素化水平。結(jié)果顯示小檗堿可以促進(jìn)細(xì)胞中BCR-ABL蛋白的泛素化，這可能是小檗堿降解BCR-ABL蛋白的作用機(jī)制。

Figure 2. The SPRi between berberine and the domain of ABL1. A: the positive control of microarray; B: the specific binding curves of the concentration gradient of SH3-SH2 in berberine microarray; C: the specific binding curves of the concentration gradient of PTK in berberine microarray; D: the specific binding curves of the concentration gradient of F-actin in berberine microarray.

圖2 表面等離子體共振成像實驗驗證小檗堿和ABL1蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)合

Figure 3. The expression level of BCR-ABL in BaF3-P210 and BaF3-P210-T315I cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

圖3 小檗堿處理BaF3-P210和BaF3-P210-T315I細(xì)胞后BCR-ABL蛋白表達(dá)水平的變化

Figure 4. The ubiquitination of the cells and BCR-ABL protein after berberine (BBR) treatment. A: the overall ubiquitination level of 293T-flag-BCR-ABL cells after BBR treatment; B: the ubiquitination of BCR-ABL after BBR treatment in 293T-flag-BCR-ABL cells.

圖4 小檗堿處理后細(xì)胞中整體的泛素化水平及BCR-ABL蛋白的泛素化水平

綜上所述，小檗堿在CML中的靶標(biāo)是CML特征性蛋白BCR-ABL,小檗堿可以促進(jìn)細(xì)胞中BCR-ABL蛋白的降解，而且是通過泛素化途徑降解BCR-ABL蛋白的。