方 立， 黃 欽， 張銀妝， 黃 芳， 苑 聰， 劉偉偉

(長沙市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科二病區(qū)， 湖南 長沙 410005)

研究表明血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)表型轉(zhuǎn)化是高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等心血管病VSMCs增殖和遷移的關(guān)鍵性起始步驟，也是該類疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)[1-2],因此，如何控制和逆轉(zhuǎn)VSMCs表型轉(zhuǎn)化是控制VSMCs異常增殖的關(guān)鍵性措施。核仁素(nucleolin)是細胞核仁中含量最多的一種RNA結(jié)合蛋白，其主要功能涉及核糖體RNA合成、核糖體裝配等的調(diào)控[3]。近期的研究表明核仁素還參與細胞生長、增殖、凋亡和炎癥免疫等生理病理過程[4]。研究表明核仁素的RNA結(jié)合特性是賦予核仁素具有多種生物學功能的重要特性，其特異的核酸結(jié)合元件為“(T/G)CCCG(A/G)”[5-7]。核仁素在不同類型或者同一類型細胞的不同狀態(tài)之間具有穿梭的特點，在大多數(shù)細胞中以細胞核表達為主，也可以糖基化或磷酸化的形式存在于細胞膜或細胞漿[8]。核仁素的表達水平與細胞分裂的速率呈正相關(guān)，在腫瘤以及其它快速分裂的細胞中核仁素的表達量相當高，而在非分裂細胞中卻非常低，因此核仁素常被用來衡量細胞增殖的程度，這些均充分提示RNA結(jié)合蛋白核仁素可能在調(diào)節(jié)細胞的增殖或表型轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮重要作用，并且核仁素的細胞穿梭功能參與了上述生物學過程。核仁素是否具有調(diào)節(jié)VSMCs表型轉(zhuǎn)化及如何發(fā)揮作用，目前尚不清楚。

本研究擬采用血管緊張素Ⅱ(angiotensin II，AngⅡ)誘導VSMCs表型轉(zhuǎn)化為細胞模型，觀察VSMCs表型轉(zhuǎn)化時核仁素mRNA和蛋白的時空表達模式;采用基因過表達及RNA干擾技術(shù)從正反兩方面觀察細胞內(nèi)核仁素對AngⅡ介導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響，旨在探討核仁素在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用，并初步探討其促表型轉(zhuǎn)化機制。

材 料 和 方 法

1 細胞培養(yǎng)

VSMCs購于上海天呈生物信息科技有限公司(ATCC來源，貨號CRL-1476TM)。正常生長培養(yǎng)基為DMEM(高糖)+10% 胎牛血清，細胞呈梭形，貼壁生長。放于CO2濃度為5%、溫度為37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中。根據(jù)實驗設(shè)計的要求，將AngⅡ稀釋成10-5mmol/L、10-6mmol/L、10-7mmol/L和10-8mmol/L不同濃度，分別刺激血管平滑肌細胞48 h。10-5mmol/L AngⅡ分別誘導培養(yǎng)VSMCs不同時間。

2 主要試劑

兔抗鼠核仁素多克隆抗體購自Sigma-Aldrich；鼠抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)單克隆抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠平滑肌蛋白22α(smooth muscle protein 22α, SM22α)多克隆抗體、鼠抗鈣調(diào)理蛋白(calponin)單克隆抗體、鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體和兔抗鼠β-微管蛋白(β-tubulin)多克隆抗體均購自Abcam；鼠抗骨橋蛋白(osteopontin，OPN)單克隆抗體和山羊抗兔或抗小鼠IgG購自Santa Cruz；小鼠抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體購自BD Biosciences；BCA蛋白濃度測定試劑盒和BeyoECL Plus化學發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；總RNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自由北京博大泰克生物技術(shù)有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自 TaKaRa；MegaTran 1.0試劑盒購自O(shè)riGene。

3 方法

3.1細胞核蛋白、胞漿蛋白的分離以及細胞總蛋白的提取 細胞處理后采用NE-PERTM細胞核和細胞漿提取試劑盒收集細胞漿和核蛋白質(zhì)成分，在-70 ℃下儲存。細胞總蛋白的提取過程：VSMCs經(jīng)相應(yīng)處理后，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，根據(jù)細胞濃度，每瓶細胞加50～80 μL 12× SDS裂解液(100 mmol/L Tris-HCl， pH 6.8；200 mmol/L DTT；40 g/L SDS；20%甘油)裂解細胞。裂解完畢后，用加樣槍將細胞碎片和裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，100 ℃煮沸變性10 min，于4 ℃下12 000 ×g離心10 min。將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5 mL的離心管中放于-70 ℃保存，使用Bicinchoninic Acid Protein Assay試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。

3.2細胞總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR分析 細胞處理后使用RNeasy試劑盒提取細胞總RNA。根據(jù)目的基因設(shè)計特異性引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。α-SMA的上游引物序列為5’-ACTGGGACGACATGGAAAAG-3’，下游引物序列為 5’-CATCTCCAGAGTCCAGCACA-3’；calponin的上游引物序列為 5’-ACTTCATGGATGGCCTCAAG-3’，下游引物序列為 5’-GTGCCAGTTCTGGGTTGACT-3’；SM22α的上游引物序列為5’-TTCTGCCTCAACATGGCCAAC-3’，下游引物序列為5’-CACCTTCACTGGCTTGGATC-3’；OPN的上游引物序列為 5’-ATGGCTTTCATTGGAGTTGC-3，下游引物序列為 5’-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3’；β-actin的上游引物序列為 5’-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3’，下游引物序列為 5’-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3’；nulceolin的上游引物序列為 5’-CAATCAGGCTGGAGTTGCAAG-3’，下游引物序列為 5’-TGGCCCAGTCCAAGGTAACTT-3’。提取的總RNA經(jīng)微量紫外分光光度計測量濃度后按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒推薦步驟進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進行real-time PCR擴增。反應(yīng)體系5 μL：cDNA 2 μL，正、反引物(10 pmol/L)各0.2 μL,Dye II 0.2 μL，加蒸餾水補充至10 μL。擴增條件為：95 ℃ 10 s預(yù)變性;95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s退火延伸，擴增40個循環(huán)。反應(yīng)和數(shù)據(jù)處理均在Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System上進行。用循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)來計算樣本中目的基因的mRNA表達量。每個目的基因均重復(fù)3次，Ct值取均值進行比較和統(tǒng)計分析。采用相對表達量計算法(2-ΔΔCt)計算各基因表達量的差異，設(shè)對照組基因表達量為1，并選擇β-actin作為內(nèi)參照。

3.3間接細胞免疫熒光檢測核仁素的定位 消化VSMCs后，接種在放置有無菌蓋玻片的6孔板中；細胞長滿約80%后，吸盡培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，各孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定20 min；用PBS洗3次，每次5 min，去固定液；0.5%Triton X-100孵育10 min；PBS洗滌后用2%BSA室溫封閉60 min；去封閉液，分別在蓋玻片上加入1∶100稀釋的抗核仁素抗體(50 μL)作用60 min；用PBS洗滌3次，每次5 min，去除未結(jié)合的 I 抗；然后再加入1∶100稀釋的FITC標記熒光 II 抗(50 μL)作用60 min；用PBS洗滌3次，每次5 min，去除未結(jié)合 II 抗；加入Hoechst 33258孵育20 min，抗熒光淬滅液封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

3.4Western blot實驗 按照實驗室常規(guī)方法進行，各處理組細胞經(jīng)相應(yīng)處理后移去培養(yǎng)液，用 4 ℃ PBS洗滌2次；加入100 μL 2× SDS蛋白裂解液裂解細胞，將裂解液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，超聲10～15 s，12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈Eppendorf管；用BCA法測定蛋白濃度；將 20 μg蛋白與 2× SDS加樣緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min；樣品經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；室溫下封閉4 h后，分別加入兔抗鼠核仁素多克隆抗體、鼠抗calponin單克隆抗體、兔抗鼠SM22α多克隆抗體、鼠抗osteopontin單克隆抗體、鼠抗α-SMA單克隆抗體和鼠抗β-actin單克隆抗體(均為1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜；洗去 I 抗后，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的相應(yīng) II 抗，反應(yīng)2 h，化學發(fā)光法顯色，掃描結(jié)果。

3.5pcDNA3.1-Nuc/siRNA-Nuc重組質(zhì)粒的擴增和提取 pcDNA3.1-Nuc/siRNA-Nuc重組質(zhì)粒由中南大學湘雅醫(yī)學院病理生理學教研室王慷慨教授惠贈。將核仁素過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Nuc或核仁素干擾RNA片段(siRNA-Nuc：5’-ACCTGCCTTCGCGA-GCTTCACCAT-3’；siRNA：5’-CATGGTGAAGCTCG-CGAAGGCAGGT-3’)轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細胞中，之后挑取單克隆菌落放于含相應(yīng)抗生素的5 mL LB培基中，置于37 ℃的搖床上，250 r/min培養(yǎng)過夜，之后轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的200 mL LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，渾濁度達到標準后收集細菌用于質(zhì)粒的抽提，搖動14～16 h。按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取siRNA-Nuc/pcDNA3.1-Nuc質(zhì)粒，基本步驟為將大腸桿菌菌液分裝入EP管，離心獲得細菌沉渣，循序加入solution試劑提取出質(zhì)粒，Wash buffer清洗，無菌超純水37 ℃孵育后洗脫，獲得質(zhì)粒。提取出的質(zhì)粒分光光度計測定DNA濃度，分裝凍存于-70 ℃冰箱備用。

3.6細胞的瞬時轉(zhuǎn)染 按照MegaTran 1.0轉(zhuǎn)染試劑操作說明書進行。轉(zhuǎn)染前給融合度為70%～90%(具體根據(jù)處理因素及處理時間)的VSMCs培養(yǎng)板換液。轉(zhuǎn)染時(以6孔板為例)每孔取2 μg質(zhì)粒，將其溶解在200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中，再將6 μL的MegaTran 1.0加入上述混合物中，混勻后室溫放置約10 min，將混合液加入6孔板中，輕輕混勻后，將6孔板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，24 h后進行下一步實驗。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，根據(jù)資料性質(zhì)采用合適的統(tǒng)計學方法，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 AngⅡ?qū)SMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

不同濃度AngⅡ刺激48 h后，VSMCs收縮表型標志物α-SMA、calponin 和 SM22α的mRNA和蛋白表達逐漸減少，而合成表型標志基因OPNmRNA和蛋白表達逐漸增加，其中AngⅡ的濃度為10-5mmol/L時效果最明顯，見圖1A、C。10-5mmol/L AngⅡ處理VSMCs不同時間后，VSMCs收縮表型標志物α-SMA、calponin 和 SM22α的mRNA和蛋白表達逐漸減少，而合成表型標志物OPN的mRNA和蛋白表達逐漸增加，其中72 h 時的效果最明顯(P<0.05)，見圖1B、D。上述結(jié)果證實AngⅡ有明顯的促進VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用。

2 AngⅡ?qū)ρ芷交〖毎泻巳仕乇磉_的影響

不同濃度AngⅡ刺激48 h后，VSMCs中核仁素mRNA和蛋白的表達在一定程度上逐漸升高，10-6mmol/L AngⅡ能明顯上調(diào)核仁素mRNA和蛋白的表達(P<0.05)。10-6mmol/L AngⅡ處理VSMCs不同時間后，核仁素mRNA和蛋白的表達也在一定程度上逐漸升高，在48 h AngⅡ能明顯上調(diào)核仁素mRNA和蛋白的表達，并持續(xù)至將近72 h(P<0.05)，見圖2A、B。利用10-6mmol/L AngⅡ處理VSMCs 12、24、 48和72 h，細胞成分分離后提取細胞核蛋白和細胞漿蛋白，采用Western blot分析核仁素蛋白的表達，結(jié)果顯示正常情況下，絕大部分的核仁素位于細胞核中，胞漿中含量較少，而AngⅡ處理后,可見胞漿中的核仁素的含量逐漸增多，細胞核內(nèi)的核仁素的含量逐漸減少(P<0.05)，見圖2C。β-tubulin和PCNA分別為胞漿蛋白和胞核蛋白的內(nèi)參照，提示成分之間無明顯污染。進一步采用間接免疫熒光證實，正常情況下絕大部分核仁素(綠色熒光物質(zhì))位于細胞核中，細胞漿中的含量較少；而10-6mmol/L AngⅡ處理VSMCs 48 h后，細胞漿中的核仁素(綠色熒光物質(zhì))明顯增多，而細胞核中的核仁素(綠色熒光物質(zhì))明顯減少，見圖2D,提示AngⅡ可誘導核仁素從細胞核向細胞漿移位。核仁素過表達能增加核仁素在細胞核和細胞漿的表達及其胞漿移位；核仁素干擾后則細胞核和細胞漿表達量及其胞漿移位減少，見圖2D。

Figure 1. RT-qPCR (A， B) and Western blot (C, D) were used to determine the effect of different concentrations (A, C) of Ang II for various time (B, D) on the expression of VSMC phenotypic transformation markers α-SMA, calponin, SM22α and OPN. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 mmol/L group.

圖1 RT-qPCR和Western blot 檢測AngⅡ?qū)SMCs表型轉(zhuǎn)化標志物α-SMA、calponin、SM22α和OPN mRNA和蛋白的影響

Figure 2. The effect of Ang II on the expression and subcellular localization of nucleolin in the VSMCs. A and B: RT-qPCR and Western blot were used to determine the effect of Ang II on the mRNA and protein expression of nucleolin in the VSMCs; C and D: Western blot and indirect immunofluorescence were used to observe the subcellular localization of nucleolin. β-tubulin and PCNA were used as the internal controls of cytoplasmic protein and nuclear protein, respectively. Nucleolin was detected with fluorescein isothiocyanate-labeled antibody (green), and nuclei were counterstained with Hoechst 33258 (violet). The magnification of the images in D was ×400. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖2 AngⅡ?qū)SMCs中核仁素表達及亞細胞移位的影響

3 核仁素過表達對Ang II誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

與正常對照細胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Nuc質(zhì)粒后，VSMCs中核仁素的蛋白表達明顯升高(P<0.05)，見圖3A。給予10-6mmol/L Ang II處理48 h，結(jié)果顯示單純Ang Ⅱ處理組及轉(zhuǎn)空載體的對照細胞經(jīng)AngⅡ處理后核仁素蛋白的表達明顯上調(diào)，而轉(zhuǎn)染核仁素基因的VSMCs經(jīng)過Ang Ⅱ處理后核仁素蛋白的表達上調(diào)更為明顯(P<0.05)，見圖3B。同時，Western blot檢測結(jié)果顯示，單純Ang II處理和轉(zhuǎn)空載體的對照細胞經(jīng)Ang II處理后，OPN蛋白的表達明顯上調(diào)，而轉(zhuǎn)染核仁素基因的VSMCs經(jīng)過Ang II處理后OPN蛋白的表達上調(diào)更為明顯(P<0.05)；與此相反，單純Ang II處理和轉(zhuǎn)染空載體的對照細胞經(jīng)Ang II處理后α-SMA、calponin和SM22a表達下調(diào)，而轉(zhuǎn)染核仁素基因的VSMCs經(jīng)過Ang II處理后α-SMA、 calponin和SM22a蛋白的表達下調(diào)更為明顯(P<0.05)，見圖3C。這些結(jié)果提示核仁素過表達可促進Ang II誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化。

Figure 3. The effect of nucleolin over-expression on Ang II-induced phenotypic transformation of VSMCs. A: the effect of nucleolin over-expression on the expression of nucleolin in VSMCs; B: the effect of nucleolin over-expression on Ang II-induced expression of nucleolin in VSMCs; C: the effect of nucleolin over-expression on Ang II-induced expression of VSMC phenoty-pic transformation markers α-SMA, calponin, SM22α and OPN. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group (without treatment);#P<0.05vspcDNA3.1 group, Ang II group or Ang II+pcDNA 3.1 group.

圖3 Nucleolin過表達對Ang II誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

4 敲減核仁素表達對Ang II誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

與正常VSMCs相比，轉(zhuǎn)染核仁素的RNA干擾載體siRNA-Nuc質(zhì)粒48 h后，VSMCs中核仁素蛋白的表達明顯受到抑制(P<0.05)，見圖4A。再給予10-6mmol/L AngⅡ處理48 h后，單純AngⅡ處理組及轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞經(jīng)過Ang II處理后，核仁素蛋白的表達明顯上調(diào)，而轉(zhuǎn)染siRNA-Nuc的VSMCs經(jīng)過Ang II處理后核仁素蛋白的表達明顯下降(P<0.05)，見圖4B。單純Ang II處理和轉(zhuǎn)染空載體的對照細胞經(jīng)Ang II處理后，OPN蛋白的表達明顯上調(diào)，而轉(zhuǎn)染核仁素RNA干擾載體后OPN蛋白的表達上調(diào)受到明顯抑制(P<0.05)；與此相反，單純Ang II處理和轉(zhuǎn)染空載體的對照細胞經(jīng)Ang II處理后α-SMA、calponin和SM22α的表達下調(diào)，而轉(zhuǎn)染核仁素RNA干擾載體后α-SMA、calponin和SM22α蛋白的表達下調(diào)受到明顯抑制(P<0.05)，見圖4C。這些結(jié)果提示核仁素表達下調(diào)后，其促進表型轉(zhuǎn)化作用被解除。

Figure 4. The effect of nucleolin silencing on Ang II-induced phenotypic transformation of VSMCs. A: the effect of silencing of nucleolin on expression of nucleolin in VSMCs; B: the effect of silencing of nucleolin on Ang II-induced expression of nucleolin in VSMCs; C: the effect of silencing of nucleolin on Ang II-induced expression of VSMC phenotypic transformation markers α-SMA, calponin, SM22α and OPN. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group (without treatment);#P<0.05vssiRNA group， Ang II group or Ang II+siRNA group.

圖4 Nucleolin低表達對Ang II誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

討 論

當血管受到損傷或體外培養(yǎng)的VSMCs受到生長因子刺激時，VSMCs從分化型轉(zhuǎn)化為去分化型并獲得增殖能力，這個過程稱為表型轉(zhuǎn)化。目前在VSMCs表型轉(zhuǎn)化機制研究中取得較大的進展，普遍認為機體內(nèi)存在內(nèi)源性活性物質(zhì)對VSMCs的增殖或表型轉(zhuǎn)化起著自發(fā)的調(diào)控作用，因此，尋找并研究介導VSMCs表型轉(zhuǎn)化新的內(nèi)源性調(diào)控蛋白是闡明其作用機制的關(guān)鍵。盡管現(xiàn)己證實多種細胞因子、生長因子和血管活性物質(zhì)參與VSMCs表型轉(zhuǎn)化，然而VSMCs表型轉(zhuǎn)化中究竟何種物質(zhì)起關(guān)鍵作用，如何起作用以及多種調(diào)控因子之間存在怎樣的相互作用，尚缺乏系統(tǒng)研究。核仁素是目前發(fā)現(xiàn)的271種核仁蛋白質(zhì)中含量最多的一種，約占核仁蛋白質(zhì)總量的10%，是真核細胞核仁中最主要的一種磷酸蛋白質(zhì)。核仁素的重要功能之一是調(diào)控核糖體的生物合成與成熟，調(diào)控細胞增殖、生長、調(diào)控胚胎發(fā)生、胞質(zhì)分裂、染色質(zhì)復(fù)制與核仁的發(fā)生等過程[9]。大量研究表明核仁素高表達于增殖較快的組織和細胞，包括干細胞和腫瘤細胞，并能促進干細胞的更新和腫瘤細胞的生長[10]。核仁素的表達水平與細胞分裂的速率呈正相關(guān)。在腫瘤以及其它快速分裂的細胞中核仁素的表達量相當高，而在非分裂細胞中卻非常低，因此作為一種有效的標記，核仁素常被用來衡量細胞增殖的程度[11]，上述研究結(jié)果提示，在病理條件下核仁素可能具有調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的作用，而核仁素是否具有調(diào)節(jié)VSMCs表型轉(zhuǎn)化，目前尚不清楚。

為了明確核仁素在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用，本研究首先以AngⅡ刺激VSMCs誘導其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)不同濃度和作用時間的AngⅡ刺激VSMCs后，VSMCs收縮表型標志物α-SMA、calponin和SM22α的mRNA和蛋白表達逐漸減少，而合成表型標志物OPN的mRNA和蛋白表達逐漸增加，上述結(jié)果證實AngⅡ有明顯的促進VSMCs表型轉(zhuǎn)化作用。為了證明AngⅡ刺激VSMCs表型轉(zhuǎn)化與核仁素表達水平的關(guān)系，本研究采用RT-qPCR及Wetern blot檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度和不同作用時間的AngⅡ刺激VSMCs后，核仁素的mRNA和蛋白的表達也在一定程度上逐漸升高。核仁素的表達改變是VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的伴隨現(xiàn)象，還是核仁素在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用目前還不清楚。根據(jù)核仁素的表達模式分析，我們假定核仁素的表達上調(diào)在AngⅡ誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化發(fā)揮了作用。AngⅡ刺激可促進核仁素表達上調(diào)，其機制是什么呢？研究發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路的活化,也可使核仁素的表達上調(diào)，而多項研究亦證實AngⅡ誘導的VSMCs增殖和表型轉(zhuǎn)化與MAPK信號通路成員細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated kinase，ERK1/2)、氨基末端激酶(Jun NH2 terminal kinase，JNK)、p38和核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)的激活有關(guān)[12-13]。因此，AngⅡ可能通過激活MAPK和NF-κB等信號通路,進而使核仁素表達上調(diào)，但其具體機制還有待于進一步探討。

核仁素含有氨基端、中心區(qū)和羧基端3個主要的功能結(jié)構(gòu)域，其中心區(qū)含有4個較為保守的序列一致型RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(consensus sequence type RNA binding domain，CS-RBD)。目前認為，核仁素氨基端的核定位信號(nuclear localization signal，NLS)、中心區(qū)的RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及羧基端的甘氨酸富集區(qū)不但決定著核仁素的核仁定位，還賦予了核仁素在細胞漿和細胞核之間進行雙向移位的特性[14]。由此可見，核仁素的細胞穿梭功能參與調(diào)節(jié)細胞的增殖與生長和凋亡等生物學過程。本研究也發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，核仁素大部分位于血管平滑肌細胞胞核中，而AngⅡ可誘導核仁素從細胞核向細胞漿移位，提示核仁素可能在AngⅡ誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化中也起作用，而且其作用機制可能有賴于它的胞漿定位功能。有研究表明核仁素向細胞漿的移位取決于Cdc2激酶誘導其氨基端蘇氨酸的磷酸化，相反去磷酸化則促進其向核轉(zhuǎn)位[15]。因此，AngⅡ可能通過激活某些激酶，導致核仁素的移位，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)VSMCs表型轉(zhuǎn)化作用，上述問題有待于進一步研究闡明。為了探討核仁素在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用，我們采用了核仁素過表達和RNA干擾策略觀察核仁素在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用，結(jié)果顯示核仁素過表達可明顯促進AngⅡ誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化，而核仁素表達下調(diào)后其促進表型轉(zhuǎn)化作用被解除。上述研究在國內(nèi)外首次證明了核仁素的表達上調(diào)及其胞漿移位在AngⅡ所致VSMCs表型轉(zhuǎn)化作用中起著關(guān)鍵的作用。

有文獻報道，核仁素的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域CS-RBD即“(T/G)CCCG(A/G)”是其參與rRNA原初轉(zhuǎn)錄本剪接和成熟調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[6-7]。除此之外，大量研究表明，這一結(jié)構(gòu)還介導了核仁素對某些基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)(調(diào)控靶基因mRNA穩(wěn)定性)，如核仁素與IL-2 mRNA的5’-非翻譯區(qū)(5’-untranslated region，5’-UTR)結(jié)合[16]、GADD45α(growth arrest and DNA damage inducible gene 45α)mRNA編碼區(qū)[17]結(jié)合，通過調(diào)控這些靶基因mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)靶基因蛋白質(zhì)的表達。核仁素的RBD結(jié)構(gòu)域可與bcl-2、AKT1和p53等多種凋亡相關(guān)基因mRNA的 5’-和 3’-UTR結(jié)合，使相應(yīng)的mRNA穩(wěn)定或去穩(wěn)定，從而發(fā)揮促細胞增殖和抗細胞凋亡作用[18]。核仁素通過其第4個RNA結(jié)合域與端粒酶RNA組分人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)結(jié)合，調(diào)節(jié)端粒酶的細胞核及核仁定位，從而調(diào)節(jié)細胞的生長與增殖[19]。最近研究還表明核仁素通過增強ABCA1的mRNA穩(wěn)定性，隨后增加膽固醇流出，抑制泡沫細胞的形成[20]。上述研究表明，核仁素的RNA結(jié)合特性，是其調(diào)節(jié)細胞的生長與增殖等多種生物學功能的關(guān)鍵。做為RNA結(jié)合蛋白，核仁素是否通過RNA結(jié)合域與表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的mRNA相結(jié)合，調(diào)控他們的穩(wěn)定性及表達，進而在AngⅡ所致VSMCs表型轉(zhuǎn)化作用中起作用呢？這些均需要進一步研究。

本研究初步證實了核仁素在AngⅡ所致VSMCs表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用, 而核仁素的表達上調(diào)和移位可能參與Ang II誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化。VSMCs表型轉(zhuǎn)化過程極其復(fù)雜，我們的研究很可能為VSMCs表型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)機制研究提供了一個新的視角，根據(jù)目前結(jié)果結(jié)合相關(guān)文獻推測核仁素可能通過其胞漿定位功能參與介導VSMCs表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的調(diào)控，影響相關(guān)基因表達,進而發(fā)揮促進表型轉(zhuǎn)化作用。因此，核仁素也很有可能成為高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等心血管病治療的一個新的藥物治療靶點。