于 敏， 姜君財(cái)， 駱妍蓓， 張 倩， 丁 菁， 陸德琴

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

高血壓是一種以體循環(huán)動(dòng)脈血壓升高為主要特點(diǎn)的臨床綜合征，可導(dǎo)致腦卒中、腎衰竭及心力衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥。高血壓的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中腎素-血管緊張素系統(tǒng) (rennin-angiotensin system, RAS) 的異常激活被認(rèn)為是其重要的發(fā)病機(jī)制之一[1]。血管緊張素Ⅱ (angiotensinⅡ, AngⅡ) 是RAS的主要組成部分，可通過(guò)與其1型受體 (AngⅡ type 1 receptor，AT1R) 結(jié)合參與多種心血管疾病的發(fā)生[2-3]。有研究報(bào)道， AngⅡ的慢性升高可導(dǎo)致內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 活性降低以及一氧化氮 (nitric oxide, NO) 生成減少，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮功能障礙 (vascular endothelial dysfunction, VED) 和高血壓的發(fā)生[2,4]。生理?xiàng)l件下，血管壁的NO主要由內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS催化生成[5-6]，eNOS/NO功能障礙是心血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。eNOS的活性調(diào)節(jié)復(fù)雜，蛋白質(zhì)翻譯后磷酸化調(diào)控是其活性調(diào)節(jié)的重要機(jī)制之一，eNOS Ser1177是其中一個(gè)重要的磷酸化位點(diǎn)，該位點(diǎn)磷酸化水平上調(diào)可增強(qiáng)eNOS活性[7]。

蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A，PP2A) 是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，其通過(guò)使蛋白質(zhì)發(fā)生可逆性去磷酸化，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化和DNA復(fù)制等多種生物學(xué)事件中發(fā)揮調(diào)控作用[8]。文獻(xiàn)報(bào)道，PP2A可使eNOS Ser1177去磷酸化而下調(diào)eNOS活性[9-10]。AngⅡ是激活PP2A的多種因素之一。研究表明，AngⅡ與心肌細(xì)胞膜上AT1R結(jié)合后可介導(dǎo)PP2A激活，進(jìn)而使心肌細(xì)胞翻譯延長(zhǎng)因子2去磷酸化，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和心肌肥大[11]。本課題組前期研究[12-13]也觀(guān)察到雙腎單夾 (two-kidney one-clip, 2K1C) 腎血管性高血壓大鼠血清AngⅡ含量升高，腸系膜動(dòng)脈PP2A活性增加、eNOS Ser1177磷酸化水平下調(diào)、eNOS活性降低及NO生成減少，并且利用PP1/PP2A抑制劑岡田酸 (okadaic acid，OA) 以及AT1R阻滯劑坎地沙坦 (candesartan，CAN) 均可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，表明AngⅡ/AT1R通路可激活PP2A，降低eNOS活性。但是，AngⅡ激活血管內(nèi)皮細(xì)胞PP2A，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的分子機(jī)制目前仍不清楚。因此，本研究利用微量滲透泵持續(xù)灌注AngⅡ的方法構(gòu)建高血壓大鼠模型，從動(dòng)物整體水平探討AngⅡ/AT1R通路激活腸系膜動(dòng)脈PP2A的分子機(jī)制，以期為臨床防治與AngⅡ密切相關(guān)的心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性6周齡Sprague-Dawley (SD)大鼠40只，體重160～200 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK (黔) 2012-0001。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

3 方法

3.1高血壓大鼠模型復(fù)制方法及實(shí)驗(yàn)分組 大鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照(control)組 (n=10)、AngⅡ組 (n=10)、CAN+AngⅡ組 (n=10)和CAN組 (n=10)。高血壓大鼠模型復(fù)制方法簡(jiǎn)單描述如下：腹腔注射3%戊巴比妥鈉 (1 mL·kg-1)麻醉后，行頸背部皮膚橫切口，在皮下埋置預(yù)先嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)充填A(yù)ngⅡ或生理鹽水的微量滲透泵，然后用手術(shù)絲線(xiàn)縫合切口，所有操作均按照外科無(wú)菌術(shù)原則。AngⅡ組及CAN+AngⅡ組埋置AngⅡ微量滲透泵 (500 ng·kg-1·min-1)，control組及CAN組埋置生理鹽水微量滲透泵 (500 ng·kg-1·min-1)。CAN+AngⅡ組與CAN組于皮下埋泵術(shù)后第1天給予坎地沙坦酯 (10 mg·kg-1·d-1) 灌胃，control組和AngⅡ組給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠均以普通飼料、自由飲水喂養(yǎng)14 d。

3.2血壓測(cè)量及高血壓判定 采用BP-300A大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x測(cè)定大鼠清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓，測(cè)量時(shí)間為埋置微量滲透泵前及埋置后3 d、7 d和14 d。每次測(cè)量均連續(xù)測(cè)6次，去掉最高值及最低值，取其余數(shù)值的平均值為當(dāng)天收縮壓值。血壓在85～120 mmHg范圍為正常血壓大鼠，凡術(shù)后血壓比自身術(shù)前血壓升高≥30 mmHg者判定為高血壓。

3.3標(biāo)本收集

3.3.1分離血清 SD大鼠取材前禁食10 h，用3%戊巴比妥鈉 (1 mL·kg-1) 腹腔麻醉后股動(dòng)脈放血，留取血液至15 mL離心管中，于4℃靜置30 min后，4 ℃、3 000×g離心15 min，取上清，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3.2分離腸系膜動(dòng)脈 取血后迅速剪開(kāi)大鼠腹腔，于心臟未停止搏動(dòng)前沿腸管壁剪取腸系膜組織，置于預(yù)冷的無(wú)菌PBS中，輕柔地將血管外脂肪、結(jié)締組織剝離后留取腸系膜動(dòng)脈血管，迅速放入液氮中冷凍，用錫箔紙包裝冷凍后的動(dòng)脈，置-80 ℃保存待用。

3.4血清AngⅡ含量測(cè)定 取-80 ℃保存的各組大鼠血清，置常溫下解凍后混勻備用。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)下讀取吸光度 (A) 值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各樣本AngⅡ含量。

3.5Western blot檢測(cè)蛋白水平 取-80 ℃保存的腸系膜動(dòng)脈組織，稱(chēng)重后加液氮研磨至細(xì)粉末狀，加入蛋白裂解液 (1 mL/g) 混勻后于冰上裂解45 min，超聲波破碎3次后，4 ℃、 12 000×g離心15 min，取上清液，BCA法測(cè)定樣品總蛋白濃度后，加入3×上樣緩沖液煮沸變性。經(jīng)10% SDS-PAGE分離，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜后分別加入相應(yīng)I抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，ECL顯影，于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光。曝光后的條帶用Image Lab圖像分析軟件進(jìn)行分析，以β-tubulin為內(nèi)參照。

3.6PP2A酶活性檢測(cè) 取-80 ℃保存的腸系膜動(dòng)脈組織，稱(chēng)重后加液氮研磨至細(xì)粉末狀，加入預(yù)冷的磷酸酶貯存緩沖液后冰上裂解45 min，4℃、 12 000×g離心45 min，取250 μL上清液，將上清液過(guò)柱后收集濾出液， 嚴(yán)格按照PP2A檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行檢測(cè)。用酶標(biāo)儀在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度 (A) 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品PP2A的酶活性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD) 表示，組間比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組收縮壓變化

與control組及自身術(shù)前相比，AngⅡ組大鼠術(shù)后第3天收縮壓顯著升高 (P<0.05)，第7天收縮壓進(jìn)一步升高 (P<0.05)，第14天在高水平持續(xù)(P<0.05)；與AngⅡ組比較，CAN+AngII組大鼠收縮壓顯著降低 (P<0.05)；control組、CAN組及CAN+AngⅡ組大鼠手術(shù)前后收縮壓以及各組間收縮壓差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 各組收縮壓的變化

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsbefore minipump implantation;△P<0.05vs3 d after minipump implantation;▲P<0.05vsAngⅡ group.

2 血清AngⅡ含量

與control組相比，AngⅡ組和CAN+AngⅡ組血清中AngⅡ含量均顯著升高 (P<0.05)，CAN組血清中AngⅡ含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 各組血清AngⅡ含量變化

Table 2. The changes of serum AngⅡ in each group (ng/L. Mean±SD.n=6)

GroupAng ⅡControl15.02±3.07AngⅡ18.42±2.07?CAN+AngⅡ17.70±3.99?CAN14.07±2.72

*P<0.05vscontrol group.

3 腸系膜動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)及eNOS Ser1177磷酸化水平

與control組相比，AngⅡ組腸系膜動(dòng)脈eNOS Ser1177磷酸化水平顯著降低 (P<0.05)，其余兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與AngⅡ組相比，CAN+AngⅡ組eNOS Ser1177磷酸化水平顯著上調(diào) (P<0.05)；各組間eNOS蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

4 腸系膜動(dòng)脈PP2A活性

與control組相比，AngⅡ組腸系膜動(dòng)脈PP2A活性顯著增高 (P<0.05)，其余兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與AngⅡ組相比，CAN+AngⅡ組PP2A活性顯著降低 (P<0.05)，見(jiàn)圖2。

5 PP2A活性與eNOS Ser1177磷酸化水平相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，PP2A活性變化與eNOS Ser1177磷酸化水平改變呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=-0.842 (P<0.05)。

6 腸系膜動(dòng)脈PP2Ac Tyr307磷酸化水平和蛋白表達(dá)

Figure 1. The protein levels of eNOS and p-eNOS (Ser1177) in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

圖1 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)及eNOS Ser1177磷酸化水平的變化

Figure 2. PP2A activity in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

圖2 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈PP2A活性變化

Figure 3. The protein levels of PP2Ac and p-PP2Ac (Tyr307) in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

圖3 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈PP2Ac表達(dá)和PP2Ac Tyr307磷酸化水平

討 論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活是導(dǎo)致高血壓的主要機(jī)制之一[14]，AngⅡ作為該系統(tǒng)中最為關(guān)鍵的血管活性物質(zhì)，參與血流動(dòng)力學(xué)和機(jī)體水鈉平衡調(diào)節(jié)[2-3]。RAS長(zhǎng)期激活，尤其是AngⅡ濃度增加可導(dǎo)致原發(fā)性高血壓的發(fā)生[15]。在自發(fā)性高血壓大鼠[16]和腎血管性高血壓動(dòng)物模型[17]中均存在RAS激活、血清和 (或) 組織中AngⅡ水平增高。本研究使用微量滲透泵持續(xù)灌注AngⅡ的方法復(fù)制高血壓大鼠模型，并檢測(cè)了各組血清中AngⅡ含量，觀(guān)察到在持續(xù)灌注AngⅡ后，大鼠血清中AngⅡ含量顯著升高，且血壓升高超過(guò)術(shù)前30 mmHg以上，提示AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型復(fù)制成功。CAN灌胃治療顯著降低AngⅡ所致的高血壓，表明在高血壓形成過(guò)程中增高的AngⅡ通過(guò)與AT1R結(jié)合使血管發(fā)生收縮導(dǎo)致血壓升高，給予CAN灌胃治療可拮抗AT1R發(fā)揮顯著降壓作用。

血管內(nèi)皮功能障礙是多種心血管疾病發(fā)病的共同始動(dòng)因素，eNOS活性降低導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO減少是引起內(nèi)皮功能障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]。eNOS的活性調(diào)控涉及基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后修飾等過(guò)程，磷酸化和去磷酸化調(diào)控是eNOS蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要機(jī)制之一，Ser1177位點(diǎn)磷酸化可顯著上調(diào)eNOS活性[7]。AngⅡ是引起eNOS Ser1177降低的一個(gè)重要因素。已有研究表明，AngⅡ可下調(diào)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS Ser1177磷酸化水平，減少NO的產(chǎn)生，其作用是通過(guò)AT1R通路所介導(dǎo)[19]。在動(dòng)物整體水平研究中同樣觀(guān)察到，高鹽性高血壓大鼠主動(dòng)脈eNOS Ser1177磷酸化水平下降，給予AT1R阻滯劑CAN治療后顯著增高eNOS Ser1177磷酸化水平，增加NO合成[20]；糖尿病小鼠主動(dòng)脈eNOS Ser1177磷酸化水平下調(diào)，AT1R阻滯劑阿奇沙坦可上調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平，改善內(nèi)皮功能[21]。本研究也觀(guān)察到AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈eNOS Ser1177磷酸化水平顯著下調(diào)，而CAN顯著逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。這些均提示AngⅡ通過(guò)AT1R通路顯著下調(diào)eNOS Ser1177的磷酸化水平，本文進(jìn)一步研究其分子機(jī)制。

既往研究已證實(shí)，PP2A參與eNOS Ser1177去磷酸化調(diào)節(jié)[9-10]。在本課題組前期研究中已檢測(cè)到2K1C高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈eNOS Ser1177發(fā)生去磷酸化、PP2A活性增高，是由AngⅡ/AT1R 通路介導(dǎo)[12]，繼續(xù)用大鼠腸系膜動(dòng)脈進(jìn)行離體水平研究，顯示20 nmol/L OA可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的eNOS Ser1177下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了AngⅡ所介導(dǎo)的eNOS Ser1177下調(diào)是因PP2A的激活而引起[13]。本研究檢測(cè)到AngⅡ誘導(dǎo)大鼠腸系膜動(dòng)脈PP2A活性顯著增高，通過(guò)分析PP2A活性與eNOS Ser1177磷酸化水平的相關(guān)性，結(jié)果表明二者呈負(fù)相關(guān)， 提示AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈eNOS Ser1177磷酸化水平下調(diào)也是由于A(yíng)ngⅡ/AT1R通路激活PP2A所致。