趙勝男，姚建伶，韓 笑，潘海峰?

（1.河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北 承德 067000；2.北京四環(huán)制藥有限公司，北京 100025；3.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河北 承德 067000）

化學(xué)計(jì)量學(xué)是一門通過數(shù)學(xué)或統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將對化學(xué)體系的測量值與體系的狀態(tài)之間建立聯(lián)系的學(xué)科，它的特點(diǎn)是可以最有效地獲取體系有用的特征數(shù)據(jù)，并通過解析測量數(shù)據(jù)最大限度地從中提取有關(guān)物質(zhì)的定性、定量、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等信息［1］?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)不僅在數(shù)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在中藥鑒別、質(zhì)量控制等研究中也越來越被接受和使用［2-9］。本研究運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)對不同采集地山楂葉藥材中采用面積歸一化法所得15 種成分的峰面積比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；應(yīng)用聚類分析與主成分分析得到30 批藥材；利用判別分析建立質(zhì)量數(shù)學(xué)表達(dá)式。

山楂葉具有活血化瘀、化濁降脂等功效，主要含有黃酮和有機(jī)酸類。其臨床制劑品種很多，如山玫膠囊［10］、心安膠囊［11］、益心酮片［11］等，主要用于心腦血管方面疾病的治療；近幾年，對活血化瘀藥物與血瘀證的相關(guān)研究已經(jīng)成為現(xiàn)代學(xué)者主要領(lǐng)域之一。大量研究表明，血瘀證的發(fā)生與粘滯性異常和血液流變等生理病理改變有關(guān)，而其中的宏觀流變學(xué)主要研究血液在不同切變率下的黏度表現(xiàn)［12］。本研究在選用符合上述質(zhì)量數(shù)學(xué)表達(dá)式要求的藥材基礎(chǔ)上，同時(shí)選取的提取工藝以《中國藥典》和成方制劑為準(zhǔn)則，以最大限度得到黃酮類成分的提取思路為模型作用于血瘀模型大鼠，以全血黏度值為指標(biāo)，在藥材質(zhì)量可追溯的基礎(chǔ)上結(jié)合大鼠全血黏度值優(yōu)選最佳山楂葉提取物制法，方法科學(xué)、更具有實(shí)用意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AG-245 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LBY-N6K 型全自動血流變儀（北京市普利生儀器有限公司）；KQ700 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 動物 Wistar 雄性SPF 級大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購于北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2012-0001。

1.3 試劑 金絲桃苷（批號111521-200303），購于中國食品藥品檢定研究院；牡荊素鼠李糖苷（批號151024）、牡荊素葡萄糖苷（批號151103），購于上海融禾有限公司，上述對照品含有量≥98%。烏拉坦（20150401），購于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；鹽酸腎上腺素（批號1505301），購于天津市金耀藥業(yè)有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，購于美國Fisher 公司；水為娃哈哈純凈水；其他試劑為分析純。

1.4 試藥 山楂葉為薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥葉，由承德民族師范學(xué)院董建新教授鑒定為正品，具體見表1。山楂葉制法A［10］（模擬山楂葉成藥山玫膠囊，山楂葉以50%乙醇為提取液）、山楂葉制法B（山楂葉藥材加5 倍量50%乙醇，加熱回流提取2 次，合并提取液用3 倍量水飽和正丁醇溶液提取3 次，合并的正丁醇提取液濃縮至干，即得）、山楂葉制法C［11］（模擬山楂葉成藥益心酮片，以山楂葉提取物D 為原料制成制劑）、山楂葉制法D（50%乙醇提取液，通過收集大孔吸附樹脂柱不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液，回收乙醇得清膏）。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 法建立

2.1.1 色譜條件［13］Aglient Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（C）；梯度洗脫（0～5 min，10%～12% B；5～15 min，12%B；15～20 min，12%B，前20 minC 占0。20～23 min，12%～14% B；23～35 min，14% B；35～40 min，14%～20% B；40～50 min，20%～30% B；50～60 min，30%～60%B；60～65 min，60%～80%B，20 min 以后C 占8%）；檢測波長320 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取山楂葉D（2015 年版《中國藥典》方法）約0.05 g，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密移取60%甲醇25 mL，精密稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，待冷卻后補(bǔ)足減失質(zhì)量，上清液以0.45 μm 微孔有機(jī)濾膜過濾，即得。

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱取金絲桃苷15.5 mg、牡荊素葡萄糖苷22.0 mg、牡荊素鼠李糖苷20.0 mg，置50 mL棕色量瓶中，甲醇溶劑定容，即得（質(zhì)量濃度分別為0.31、0.44、0.40 mg／mL），密封備用。

2.1.4 樣品測定方法 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，測得金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷峰面積RSD 分別為1.88%、1.06%、0.95%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（24號）適量，在“2.1.1”項(xiàng)條件下于0、2、4、8、12、24 h測定，測得金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷峰面積RSD 分別為1.45%、1.04%、0.78%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（24 號）適量，按“2.1.2”項(xiàng) 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液，平 行6 份，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測得金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷峰面積RSD 分別為1.49%、0.88%、0.52%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批樣品（24 號）適量，分別加入一定量的金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測得金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷加樣回收率分別為99.43%、99.66%、99.80%，RSD 分 別 為2.20%、1.16%、0.51%，結(jié)果 與2015 版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)符合。

2.3 主成分分析 采用SPSS19.0 軟件中的因子分析，以降維思想為指導(dǎo)，對應(yīng)用面積歸一化法獲得的不同采集地山楂葉中15 個(gè)成分的峰面積比例含有量進(jìn)行處理。結(jié)果，前5 個(gè)成分的特征值均大于1，但總方差的累積貢獻(xiàn)率為72.879%，偏小，若提取前8 個(gè)成分，累積貢獻(xiàn)率可達(dá)87.279%＞85%，表明前8 個(gè)主成分才可反映不同批次山楂葉的質(zhì)量。再計(jì)算山楂葉藥材的主成分得分，見圖2，可知樣品分為2 類，其中1 號樣品處于2 類樣品區(qū)域的交界處，并不能明確歸類，為了保證山楂葉質(zhì)量，剔除該批樣品，所以9、11、21 及15～18 為Ⅰ類，其余30 批樣品聚為Ⅱ類，而且由于Ⅰ類樣品相對Ⅱ類樣品數(shù)目較少，分散，可當(dāng)作質(zhì)量不穩(wěn)定樣品篩除，Ⅱ類樣品為優(yōu)質(zhì)山楂葉。

圖2 主成分得分圖

2.4 聚類分析 利用面積歸一化法將表1 山楂葉中金絲桃苷等15 種成分（色譜峰見圖1）的峰面積比例輸入SPSS19.0 軟件，采用組內(nèi)聯(lián)接法，同時(shí)以歐式距離為區(qū)間進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)類間距在15～25 時(shí)，藥材被分為兩類。1、9、11、21 及15～18 為Ⅰ類，其余30 批為Ⅱ類。

2.5 判別分析 應(yīng)用SPSS19.0 軟件中分類判別，利用貝葉斯判別函數(shù)系數(shù)法對Ⅱ類藥材建立矩陣，表達(dá)式為Y=-16.241+0.335X1+2.302X2+0.313X3+0.317X4+0.209X5+0.446X6+0.522X7+1.572X8+0.578X9+2.664X10+0.790X11-0.313X12-0.498X13+0.156X14-1.615X15，其中X1～X15分別代表圖1 中色譜峰1～15 的峰面積比例。把Ⅱ類藥材所有峰面積比例的平均值代入上述表達(dá)式，得Y值為14.611。當(dāng)有未知質(zhì)量樣品的Y值范圍在90%～110%（13.15～16.08）之間時(shí)，此樣品質(zhì)量穩(wěn)定可靠，可作為供試品進(jìn)行深入研究。

圖3 38 批樣品聚類樹狀圖

2.6 各制備方法提取物對血瘀模型大鼠全血黏度的測定方法建立

2.6.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥 Wistar 大鼠（雄性）隨機(jī)分為15 組，每組8 只，分別為制備方法A、B、C、D 的高、中、低劑量組，模型組，空白組。各給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，均用同樣體積的0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液溶解，空白組與模型組平行處理，每天給藥1 次，連續(xù)8 d。

2.6.2 血瘀模型大鼠建立 大鼠第7 天給藥后除空白組皮下注射給予生理鹽水外，其余組均頸背部皮下注射鹽酸腎上腺素，劑量為0.8 mg／kg，2 h 后除空白組外其余各組大鼠均浸入冰水中（4 ℃）5 min。冰浴結(jié)束2 h后，再次注射同劑量鹽酸腎上腺素。

2.6.3 指標(biāo)測定與數(shù)據(jù)處理 第8 天給藥1 h 后取血，20%烏拉坦麻醉（5.0 mg／kg）后腹主動脈取血，取約4.0 mL加入有肝素鈉抗凝劑的EP 管中，全血使用全自動血流變儀測定全血黏度。計(jì)量數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2.6.4 不同制備方法的山楂葉對全血黏度的影響 與空白組比較，模型組高、中、低切變率全血黏度值均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，山楂葉A、B、C、D 高、中、低劑量組在不同切變率下對全血黏度值均有不同程度影響，其中D 在3 個(gè)切變率下各劑量全血黏度均顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 不同制備方法山楂葉提取物對全血黏度的影響（mPa·s，±s）

表2 不同制備方法山楂葉提取物對全血黏度的影響（mPa·s，±s）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

3 討論

2015 年版《中國藥典》一部中，山楂葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括性狀鑒定、薄層色譜鑒別以及山楂葉總黃酮和金絲桃苷的測定。目前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在質(zhì)控指標(biāo)單一，與藥效關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)等問題。本研究在課題組成果-山楂葉指紋圖譜基礎(chǔ)上，以中藥多組分作用特點(diǎn)，盡可能多的選取色譜峰為研究目標(biāo)，同時(shí)采用面積歸一化法測定了指標(biāo)成分的比例值，面積歸一化法可體現(xiàn)每種成分所占總成分的含有量百分比，與中藥多組分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)相呼應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)又利用化學(xué)計(jì)量學(xué)中聚類分析和主成分分析法，以指標(biāo)成分比例值為分析目標(biāo)，從不同采集地中排除安徽、廣東乳源、廣東南昆山、廣西桂林、廣西賀州、廣西梧州、廣西玉林及山東維安，最終剩余多個(gè)采集地的山楂葉質(zhì)量可靠、穩(wěn)定。篩選出的山楂葉樣品采用判別分析，建立了質(zhì)量數(shù)學(xué)表達(dá)式，如有未知質(zhì)量的山楂葉樣品，可把每個(gè)色譜峰面積比例值直接帶入數(shù)學(xué)式中，當(dāng)Y值范圍在13.15～16.08 時(shí)，未知山楂葉質(zhì)量符合要求，該藥材質(zhì)量評價(jià)的方法簡便、可靠。

本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)選出山楂葉藥材基礎(chǔ)上，以活血化瘀藥效實(shí)驗(yàn)對不同制備方法的山楂葉提取物進(jìn)行評價(jià)。本研究所選取的4 種制備方法山楂葉提取物通過血瘀模型大鼠全血黏度值變化，最終確定4 種制備方法山楂葉提取物均對大鼠全血黏度有不同程度的作用。但是綜合不同制法的高、中、低濃度作用于大鼠全血黏度，制備方法D 在低濃度就有顯著性差異，而且在不同切變率下均具有顯著性差異，最終制備方法D 在全血黏度這項(xiàng)指標(biāo)上效果更加明顯，與活血化瘀作用關(guān)聯(lián)度更加緊密，更加具有實(shí)用意義，為最優(yōu)制備方法提取物。

本研究既保證活血化瘀藥效試驗(yàn)樣本質(zhì)量的可追溯性，又以藥效試驗(yàn)評價(jià)山楂葉制備方法，即篩選優(yōu)良藥材-建立質(zhì)量數(shù)學(xué)表達(dá)式-符合質(zhì)量要求藥材進(jìn)行主要藥效學(xué)試驗(yàn)-最優(yōu)提取物制備方法選擇。