梁健欽 ，林憶龍 ，盧 卓，熊萬娜，陳丹丹，陳基強(qiáng)，黎 芳

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530023）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是消化內(nèi)科常見疑難病，診斷、治療復(fù)雜，預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，我國潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病率約11.6／10 萬，呈上升趨勢(shì)。潰瘍性結(jié)腸炎按“炎癥-不典型增生-癌癥”規(guī)律演進(jìn)，癌變概率5%～10%［1］。據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)《中國腫瘤防治進(jìn)展（2018 年）》公布的最新數(shù)據(jù)顯示結(jié)直腸癌（CAC）發(fā)病率排名前五，男性結(jié)直腸癌上升最為顯著，可見潰瘍性結(jié)腸炎的危害不容忽視。因此，臨床亟待尋找更多的有效藥物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎進(jìn)行早期診斷、治療，降低癌變風(fēng)險(xiǎn)。

本課題組［2］與文獻(xiàn)［3］證實(shí)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠給予芒果苷后，結(jié)腸組織MPO 活性降低，炎癥因子水平（IL-1β、IL-6、TNF-α）和ICAM-1、NF-κB p65 蛋白表達(dá)下調(diào)，顯示芒果苷良好的防治潰瘍性結(jié)腸炎的作用。但是，未見從整體化、系統(tǒng)性、更深層面研究芒果苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

近年基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥及其復(fù)方的作用機(jī)制是一個(gè)熱點(diǎn)，它整合各種藥物、生物學(xué)數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)手段分析，構(gòu)建“藥物-基因-靶點(diǎn)蛋白-疾病網(wǎng)絡(luò)”的預(yù)測(cè)模型，適合從“整體觀”研究中醫(yī)藥的作用靶點(diǎn)、作用機(jī)制［4］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析芒果苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分析，最后通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)，為發(fā)現(xiàn)芒果苷的作用靶點(diǎn)及機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 EL104 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；RM 石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司）；-80 ℃超低溫冰箱（中國美菱低溫科技有限責(zé)任公司）；BX-53 型高清電子顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 試藥 芒果苷（自制，從漆樹科植物芒果MangiferaindicaL.的枝葉提取純化得到，經(jīng)HPLC 檢測(cè)含有量≥98%）。葡聚糖硫酸鈉（DSS，分子量36 000～50 000，美國MP Biomedicals 公司）；便隱血（OB）試劑（匹拉米洞半定量檢測(cè)法，珠海貝索生物技術(shù)公司）；抗COX2（D5H5）單克隆抗體、STAT3（D1B2J）單克隆抗體均購自CST 公司；SP 試劑盒和DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.3 軟件及數(shù)據(jù)庫 PharmMapper（version 2017，http：//lilab.ecust.edu.cn／pharmmapper／index.php）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／）、Drugbank 數(shù)據(jù) 庫（version 5.1.1，https：//www.drugbank.ca／）、UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org／）、String 數(shù)據(jù)庫（version 10.5，https：//string-db.org／）、Cytoscape（version 3.6.1 ）、Autodock Vina（version 1.1.2 ）、OpenBabel（version 2.4.1）、潰 瘍 性 結(jié) 腸 炎SF Chimera（version 1.13.1rc）、PyMOL（version 2.2）。

1.4 動(dòng)物 Balb／c 小鼠，SPF 級(jí)，雄性，體質(zhì)量16～20 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002］。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，室溫20～25 ℃。

2 方法與結(jié)果

2.1 化合物選擇及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 前期研究表明［5］，芒果苷口服給藥后，部分芒果苷可被腸道菌群降解為苷元，最終以芒果苷及其苷元的形式吸收入血，因此選擇芒果苷及其苷元作為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的化合物。通過PubChem Compound數(shù)據(jù)庫檢索，獲得芒果苷及其苷元的PubChem CID，導(dǎo)入OpenBabel 軟件，獲得化合物3D 結(jié)構(gòu)，并保存為mol2 格式文件。將芒果苷及其苷元的mol2 格式文件上傳至Pharm-Mapper 在線數(shù)據(jù)庫，采用反向藥效團(tuán)法進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，按Fit score 排序輸出前100 個(gè)靶點(diǎn)。預(yù)測(cè)得到的靶點(diǎn)經(jīng)過去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到135 個(gè)靶點(diǎn)，然后通過UniProt 數(shù)據(jù)庫對(duì)所有靶點(diǎn)名稱校正為官方名稱（Official Symbol）［6］。

2.2 潰瘍性結(jié)腸炎的疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及聚類分析 通過TTD 和 Drugbank 數(shù) 據(jù) 庫 檢 索，關(guān)鍵詞 為“Ulcerative colitis”，去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到30 個(gè)潰瘍性結(jié)腸炎的疾病靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape 建立30 個(gè)疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，去除沒有相互聯(lián)系的靶點(diǎn)（2 個(gè)）。節(jié)點(diǎn)的大小由degree 決定，degree 越大，節(jié)點(diǎn)越大；節(jié)點(diǎn)顏色由聚類系數(shù)決定，顏色相近的節(jié)點(diǎn)為同一類（以下所有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖均適用）。將靶點(diǎn)按Degree 排序（括號(hào)內(nèi)為該蛋白Degree）如下：TNF（16）、IL-6（15）、PTGS2（12）、ICAM1（12）、PTGER4（10）、MMP9（9）、IL-13（9）、HRH2（8）、IL-1A（8）、CXCL10（7）、MTOR（7）、MC5R（6）、MC1R（6）、MC4R（6）、MC3R（6）、MC2R（6）、ITGA4（5）、NFKB2（4）、MADCAM1（4）、RPS6KB1（4）、PTGS1（4）、ATP4A（4）、SERPINC1（3）、CCKBR（2）、ITGB7（2）、WWOX（2）、IL-13RA2（2）、ATP4B（1）、NDOR1（0）、ETFDH（0）。將 該 網(wǎng) 絡(luò) 靶 點(diǎn) 通 過MCODE 插件進(jìn)行聚類分析（K-Core=2，其他參數(shù)為默認(rèn)值），得到2 個(gè)子網(wǎng)絡(luò)（亦即疾病靶點(diǎn)可以分成2 類，見圖1）。其中左側(cè)網(wǎng)絡(luò)15 個(gè)靶點(diǎn)為最重要的一類，TNF、IL-6、PTGS2（即COX2）是節(jié)點(diǎn)度排名前3 的靶點(diǎn)。由此可見，炎癥在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展過程中非常重要，除了TNF、IL-6 外，PTGS2（COX2）也是非常重要。

2.3 化合物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（TTN）構(gòu)建及PPI 分析 將135 個(gè)化合物潛在靶點(diǎn)和30 個(gè)疾病靶點(diǎn)共計(jì)165 個(gè)靶點(diǎn)，導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，去除無相互作用的靶點(diǎn)（9個(gè)），將相互作用靶點(diǎn)的互作結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 進(jìn)行可視化分析，得到由156 個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 084 條邊組成的網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)密度為0.090，平均節(jié)點(diǎn)度為13.9，平均combined score 為0.652，見圖2。GO 分析結(jié)果顯示，生物過程與內(nèi)源性刺激、有機(jī)物、激素、脂質(zhì)反應(yīng)等908 個(gè)生物過程有關(guān)，分子功能與催化、離子結(jié)合、小分子結(jié)合等111 個(gè)分子功能有關(guān)；KEGG 分析結(jié)果顯示，165 個(gè)靶點(diǎn)主要富集在代謝通路、催乳素信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、腫瘤通路、肺結(jié)核通路、TNF 通路、流感病毒通路、PI3K-Akt 通路等131條信號(hào)通路。

圖1 潰瘍性結(jié)腸炎疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及聚類分析結(jié)果

2.4 化合物-靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（CTTN）構(gòu)建 在上述TTN 中選取combined score＞0.652 的邊（edge，即蛋白的作用關(guān)系），共篩選出31 靶點(diǎn)作為化合物作用于疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)［分別是SRC（34）、CASP3（30）、MAPK8（29）、JAK2（24）、F2（24）、HSP90AA1（23）、HRAS（21）、NOS2（20）、STAT1（19）、IGF1R（19）、INSR（19）、REN（16）、SELE（16）、AR（15）、MAP2K1（15）、CASP1（14）、ABL1（13）、SOD2（13）、EIF4E（10）、RHEB（10）、ELANE（10）、PDPK1（9）、MMP3（8）、F7（8）、FKBP1A（6）、HCK（6）、CHEK1（5）、HPRT1（3）、PLA2G10（3）、IL-13RA2（3）、FKBP1B（2），括號(hào)內(nèi)為節(jié)點(diǎn)degree 值］。這31 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)可作用于15 個(gè)潰瘍性結(jié)腸炎疾病靶點(diǎn) ［分別是IL-6（37）、TNF（35）、PTGS2（28）、MTOR（26）、MMP9（26）、ICAM1（24）、IL-13（19）、RPS6KB1（18）、IL-1A（13）、CXCL10（13）、SERPINC1（10）、NFKB2（9）、PTGS1（8）、PTGER4（5）、ITGB7（2），括號(hào)內(nèi)為節(jié)點(diǎn)degree 值］。由圖3所示，芒果苷雖然不能直接作用于潰瘍性結(jié)腸炎疾病靶點(diǎn)，但是可通過改善炎癥（JAK／STAT、NF-κB 等通路）通路相關(guān)靶點(diǎn)達(dá)到緩解治療潰瘍性結(jié)腸炎的目的，這充分體現(xiàn)了芒果苷治療潰瘍性結(jié)腸炎的多靶點(diǎn)特性。

將31 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與15 個(gè)疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入到String 數(shù)據(jù)庫，得到由46 個(gè)節(jié)點(diǎn)、360 條邊組成的網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)密度為0.348，平均節(jié)點(diǎn)度為15.7。GO 分析結(jié)果顯示，生物學(xué)過程與脂多糖、有機(jī)氮化合物、含氧化合物、脂質(zhì)反應(yīng)等642 個(gè)生物學(xué)過程有關(guān)；分子功能與蛋白／受體／碳水化合物衍生物／離子的結(jié)合、蛋白激酶活性等43 個(gè)分子功能有關(guān)。KEGG 分析結(jié)果顯示，46 個(gè)靶點(diǎn)富集在腫瘤通路、TNF 通路、PI3K-Akt 通路、流感病毒通路、胰島素通路等106 條信號(hào)通路有關(guān)。本研究對(duì)前10 的通路及匹配基因（表1）分析，發(fā)現(xiàn)芒果苷可通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、生存、血管增生、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲、細(xì)胞分化等，調(diào)控腫瘤信號(hào)通路、Hepatitis B 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、IBD（炎性腸病）信號(hào)通路等，體現(xiàn)了芒果苷多通路的作用特點(diǎn)，其中部分信號(hào)通路（如PI3K-Akt、TNF、IBD）已明確與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

圖2 化合物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)（TTN）網(wǎng)絡(luò)

圖3 化合物-靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)（CTTN）網(wǎng)絡(luò)

表1 芒果苷治療潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 富集分析

2.5 分子對(duì)接模擬芒果苷與COX2 的結(jié)合能力 包括COX2 在內(nèi)，參與免疫反應(yīng)早期和炎癥的許多分子（TNFα、IL-1β、IL-6 等）受NF-κB 通路的調(diào)控，不少研究報(bào)道芒果苷可下調(diào)炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）水平起抗炎作用，可能與其作用于炎癥信號(hào)通路（JAK／STAT、NFκB 等通路）有關(guān)。然而，由上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果推測(cè)，COX2 是潰瘍性結(jié)腸炎的重要靶點(diǎn)，但芒果苷并不直接作用于COX2。因此，采用分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)上述推論加以驗(yàn)證。見圖4。

圖4 分子對(duì)接模擬芒果苷-COX2 的結(jié)合模型

2.5.1 受體、配體分子的構(gòu)建 通過RCSB 數(shù)據(jù)庫檢索，下載PTGS2（COX2）的PDB 格式文件，經(jīng)PyMOL 去除配體后保存為PDB 文件，導(dǎo)入Autodock Vina，經(jīng)去水、加氫處理后，將COX2 的活性位點(diǎn)設(shè)為柔性殘基、其他部分為剛性殘基，分別保存為PDBQT 文件。通過潰瘍性結(jié)腸炎SF Chimera 獲取芒果苷3D 結(jié)構(gòu)，保存為PDB 文件。

2.5.2 分子對(duì)接 AutoGrid 參數(shù)設(shè)置：各軸點(diǎn)數(shù)為（X=80、Y=60、Z=110），Grid Box 中心點(diǎn)為（x=42.0，y=34.0，z=36.0），運(yùn)行Autodock Vina，采用軟件默認(rèn)參數(shù)，獲得對(duì)接結(jié)果。從圖4 可知，芒果苷可與PTGS2 活性口袋的9 個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，其結(jié)合自由能分別為-4.94、-4.59、-2.96、-2.36、-1.69、-1.27、-0.92、-0.76 和-0.16 kcal／mol。經(jīng)能量比較可知，位點(diǎn)1 是最佳結(jié)合位點(diǎn)，但Ki預(yù)測(cè)值為238.38 μmol／L。

2.6 葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的制備及芒果苷的干預(yù)

2.6.1 分組與造模 小鼠按體重隨機(jī)分成空白組、模型組、芒果苷組，每組10 只?？瞻捉M給予蒸餾水，其余各組自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉溶液，芒果苷組在造模同時(shí)灌胃給予芒果苷（150 mg／kg），連續(xù)7 d［2］。

2.6.2 標(biāo)本的采集與處理 于實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谔幩绖?dòng)物，剖取結(jié)腸，用生理鹽水洗凈，取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織用10%中性福爾馬林固定液固定，經(jīng)石蠟包埋、切片，用于HE 染色和免疫組化染色。

2.6.3 HE 染色和免疫組化法測(cè)定COX2、STAT3 蛋白表達(dá) 取結(jié)腸組織石蠟切片脫蠟、水化，其余按試劑盒操作。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)［7］：COX2 的陽性染色為黃色或棕黃色顆粒分布于胞質(zhì)、細(xì)胞膜；STAT3 陽性染色為棕黃色或棕色顆粒分布于胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)。每張切片隨機(jī)觀察5 個(gè)視野。陽性細(xì)胞比例計(jì)分：＜5%，0 分；5%～25%，1 分；26%～50%，2 分；51%～75%，3 分；＞75%，4 分。染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色，0 分；淡黃色，1 分；棕黃色，2 分；棕褐色，3 分?？偡譃閮身?xiàng)計(jì)分之和：0～1 分，陰性；2～3分，弱陽性；≥4 分，強(qiáng)陽性。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

如圖5 所示，空白組杯細(xì)胞完整，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大量杯細(xì)胞消失，部分標(biāo)本出現(xiàn)潰瘍，全組有明顯炎癥浸潤(rùn)，波及肌層甚至全層；芒果苷組杯細(xì)胞部分缺失，部分標(biāo)本出現(xiàn)杯細(xì)胞重新長(zhǎng)出的現(xiàn)象，炎癥緩解，表明芒果苷具有緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的作用。COX2 的陽性表達(dá)主要在細(xì)胞核上，少量在胞質(zhì)，STAT3 的陽性表達(dá)主要在細(xì)胞核。與空白組比較，模型組COX2 和STAT3 陽性細(xì)胞明顯增多、密度增大，提示模型組陽性表達(dá)明顯強(qiáng)于空白組，經(jīng)芒果苷干預(yù)后陽性表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

芒果苷是從芒果葉中提取得到的黃酮類物質(zhì)，廣西民間常用芒果葉治療上呼吸道疾病。已有研究表明芒果苷可抑制COX，并能調(diào)節(jié)SOD、MDA、NO、TNF-α、IL-8 水平，從而發(fā)揮抗炎作用［8］，但芒果苷是否直接作用于COX2 等炎癥靶點(diǎn)未見報(bào)道。課題組發(fā)現(xiàn)，芒果苷由于溶解度低、吸收慢，導(dǎo)致灌胃給予芒果苷后胃腸道全段均出現(xiàn)不同程度的殘留［9-10］，芒果苷的吸收特性及其抗炎作用，是其治療潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵。為了闡明芒果苷治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析了芒果苷與靶點(diǎn)的作用關(guān)系。

TNF-α、IL-6、IL-1β、COX2 等靶點(diǎn)是潰瘍性結(jié)腸炎最主要的靶點(diǎn)，芒果苷可能通過作用于SRC、CASP3、MAPK8、JAK2 等多靶點(diǎn)間接作用（非直接作用）于上述疾病靶點(diǎn)發(fā)揮作用。從疾病網(wǎng)絡(luò)研究結(jié)果顯示，與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展相關(guān)的最主要的靶點(diǎn)蛋白包括TNF-α、IL-6、COX2、IL-1β 等。臨床上，潰瘍性結(jié)腸炎內(nèi)科處理國際指南（2015 年多倫多共識(shí)）建議使用抗TNF 單抗、維多珠單抗靶向抑制TNF-α 治療潰瘍性結(jié)腸炎，同時(shí)TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平反映疾病進(jìn)程，這2 點(diǎn)足以證明TNF-α、IL-6、IL-1β 的重要性。環(huán)氧酶（COX）是催化花生四烯酸合成各種前列腺素（PGs）和其他二十烷類的關(guān)鍵酶，COX有兩種同工酶，即組成型酶COX1 和誘導(dǎo)性酶COX2，其中COX2 可被多種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子誘導(dǎo)，參與組織炎癥過程及細(xì)胞的分化增殖過程［11］。研究表明正常結(jié)腸黏膜不表達(dá)COX2，而炎癥黏膜上皮細(xì)胞及結(jié)腸固有層單核炎性細(xì)胞大量表達(dá)COX2，并且在炎癥活動(dòng)期結(jié)腸固有層和肌間神經(jīng)叢中COX2 mRNA 表達(dá)水平明顯高于非活動(dòng)期［12］。本文分子對(duì)接結(jié)果顯示，芒果苷可與COX2 結(jié)合最低能量?jī)H為-4.94 kcal／mol，Ki高達(dá)238.38 μmol／L，提示芒果苷與COX2 活性位點(diǎn)結(jié)合能力不強(qiáng)，但是免疫組化結(jié)果卻證明芒果苷可以下調(diào)COX2 表達(dá)，可推測(cè)芒果苷間接作用于COX2。

圖5 芒果苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的影響（n=10）

從圖2 結(jié)果可知，SRC、CASP3、MAPK8、JAK2 等是芒果苷及其苷元最主要的靶點(diǎn)，而這些靶點(diǎn)可直接作用于包括TNF-α、IL-6、IL-1β、COX2 在內(nèi)的疾病靶點(diǎn)。SRC 是一種與細(xì)胞膜結(jié)合的非受體酪氨酸激酶，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、黏附、存活等多種功能，在腸道疾病中高表達(dá)，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，一些小分子SRC 抑制劑已經(jīng)到臨床試驗(yàn)階段［13］，本實(shí)驗(yàn)中SRC 可與包括15個(gè)疾病蛋白在內(nèi)的74%（34／46）的關(guān)鍵蛋白作用。CASP3是細(xì)胞凋亡途徑中Caspase 級(jí)聯(lián)激活下游的關(guān)鍵角色，腸細(xì)胞的異常調(diào)亡可能會(huì)造成腸黏膜屏障破壞、受損或喪失，最終導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生［14］，本實(shí)驗(yàn)中CASP3 可與包含13 個(gè)疾病蛋白在內(nèi)的65%（30／46）的關(guān)鍵蛋白作用。MAPK8 是MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)中重要的信號(hào)分子，其功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等各種機(jī)制，與Fas等參與細(xì)胞凋亡引發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎［15］，本實(shí)驗(yàn)中MAPK8可與63%的關(guān)鍵蛋白作用。JAK2 作為JAKs 家族的重要成員之一，可與STAT 家族多個(gè)成員如STAT3 構(gòu)成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可直接或間接性的參與細(xì)胞生命活動(dòng)、炎性反應(yīng)，潰瘍性結(jié)腸炎中JAK2 和STAT3 高表達(dá)［16］，本文中JAK2節(jié)點(diǎn)度為24，芒果苷可以顯著下調(diào)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠JAK2下游蛋白STAT3 的高表達(dá)。以上可推測(cè)，TNF-α、IL-6、IL-1、COX2 等靶點(diǎn)是潰瘍性結(jié)腸炎最主要的靶點(diǎn)，但是芒果苷不能直接作用于這些疾病靶點(diǎn)發(fā)揮藥理作用，而是通過直接作用于SRC、CASP3、MAPK8、JAK2 等靶點(diǎn)。

芒果苷可能通過間接作用，調(diào)控JAK／STAT、NF-κB 等多條通路發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。潰瘍性結(jié)腸炎的病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為與PI3K／AKT／mTOR、NF-κB、TLR4／My D88／NF-κB、MAPK、JAK／STAT、Wnt

和Notch 等多條信號(hào)通路引起的免疫、腸道菌群等多方面異常有關(guān)［17］。雖然有研究從NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路探討了芒果苷治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，但與疾病發(fā)生發(fā)展的多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路相比，顯然缺乏整體性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)芒果苷及其苷元關(guān)鍵靶點(diǎn)及其作用的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG 富集分析，GO 功能富集分析結(jié)果提示這些靶點(diǎn)主要參與了細(xì)胞因子調(diào)控、細(xì)胞存活、遷移、增殖、凋亡等生物學(xué)過程和分子功能；KEGG 富集分析結(jié)果顯示這些靶點(diǎn)主要富集到與炎癥、免疫、腫瘤相關(guān)的通路上，比如JAK／STAT3 和NF-κB 通路。

JAK／STAT3 和NF-κB 通路與潰瘍性結(jié)腸炎病情發(fā)展存在相關(guān)性。SRC 可介導(dǎo)JAKs-SRC-STATs、SRC-Shc-Ras-MER-ERK、SRC-Shc-PI3K 等通路，參與細(xì)胞因子調(diào)控，以及細(xì)胞遷移、增殖等功能［13］。此外，NF-κB 和STAT3 主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到適當(dāng)?shù)耐饨绱碳と鏣NF-α、IL-6、LPS 等，NF-κB 和STAT3 被激活，活化后 的NF-κB 和STAT3 進(jìn)入細(xì)胞核與DNA 結(jié)合介導(dǎo)下游炎癥因子（TNFα、IL-1β、COX2）的表達(dá)。從本文結(jié)果看，雖然芒果苷可能不直接作用于TNF-α、IL-1β、IL-6、COX2，但芒果苷可能通過SRC、JAK2、STAT3 等蛋白影響JAKs-STATs、NFκB 通路，最終調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β、IL-6、COX2 水平，免疫組化結(jié)果證實(shí)了芒果苷可以下調(diào)COX2、STAT3 蛋白表達(dá)，說明結(jié)腸炎癥得到控制。

值得注意的是，CASP3 和MAPK8 節(jié)點(diǎn)度很高，推測(cè)芒果苷可能還影響細(xì)胞凋亡、自噬過程，有待進(jìn)一步研究。