雷 蕾 ，鄧 鑫 ，鄭 堯，李 燕，周永峰，任永申?，張 萍?

（1.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.解放軍第302 醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)中心，北京 100039）

急性軟組織損傷（ASTI）系指人體運動系統(tǒng)、皮膚以下骨骼之外的組織受到不同致傷因素的作用，造成組織急性破壞和組織生理功能的暫時紊亂而產(chǎn)生損傷，但無骨折、脫位［1］。臨床癥狀主要表現(xiàn)為局部疼痛腫脹、局部青紫瘀斑及功能障礙等［2-3］。ASTI 發(fā)生的早期，公認的緊急處置的方法有冷敷、抬高肢體、加壓包扎等，在創(chuàng)傷初期可以起到控制傷情發(fā)展的作用；軟組織損傷亞急性期的處理包括冷療、熱療、冷熱交替療法，ASTI的盡早治療可減輕病情，緩解傷痛，對促進機體恢復(fù)具有重要意義。

但是，傳統(tǒng)的冷療、熱療及冷熱交替療法所需要的處理手段（冰袋、熱水袋等）在一些戶外環(huán)境或極端環(huán)境下不可即得，給早期治療帶來諸多不便，增加了患者的痛苦，亟需開發(fā)一種便于攜帶備用的有針對性的高效的復(fù)合型藥物理療產(chǎn)品。鑒于目前市場上出現(xiàn)的冷敷理療產(chǎn)品，只有致冰感基質(zhì)而無針對性藥物以增強療效；傳統(tǒng)中藥在活血化瘀、抗炎、抗氧化、止痛等方面具有特殊療效，為開發(fā)外傷治療產(chǎn)品提供了依據(jù)?；诖?，本項目在前期研究應(yīng)用基礎(chǔ)上，開發(fā)了一種基于凝膠基質(zhì)的中藥冰感冷療貼，主藥為黃芩提取物、冰片、薄荷油、絲瓜水等。本研究采用自由落體組織損傷法建立ASTI 大鼠模型，對黃芩冷療凝膠對ASTI 的治療作用進行觀察，并與冷療凝膠基質(zhì)、熱敷理療以及冷熱交替理療方式進行對比，并對其抗氧化指標(biāo)及其可能的作用機制進行了探討。

1 材料與儀器

1.1 試藥 冰片、薄荷油、黃芩（亳州市真源堂藥業(yè)有限公司，批號分別為20170508、20170607、20170620），黃芩經(jīng)中南民族大學(xué)劉新橋副教授鑒定為唇形科黃芩屬植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，提取物參照2015年版《中國藥典》一部項下方法制備［4］。絲瓜水為絲瓜莖傷流液，采用截蔓自流法收集過濾得到。熱敷貼為市售暖足理療貼（瑞安市大地日用品有限公司，批號Q／RDDR001-2014）；扶他林（北京諾華制藥有限公司，批號H19990291）。硫化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20170914）；氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號1611130801）；其他試劑均為分析純或藥用輔料。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、蛋白定量測試盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20171122、20171125、20171124）。

1.2 動物 SD 大鼠，雄性，SPF 級，體質(zhì)量200～220 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，動物使用許可證號SYXK（鄂）2016-0089。

1.3 儀器 軟組織打擊器（自制）；DL28R 冷凍離心機（上海離心機械研究所）；分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；酶標(biāo)儀1510（美國Thermo Fisher 公司）。

2 方法

2.1 冷療凝膠基質(zhì)及黃芩冷療凝膠的制備 冷療凝膠基質(zhì)制備方法，在攪拌下，將1 g 卡波沫940、5 g 甘油和0.2 g吐溫-80 混勻，加適量絲瓜水約30 mL 攪拌至卡波沫940 全部分散；取氫氧化鈉0.4 g 溶于10 mL 純化水，逐漸攪拌加入卡波沫液體中，再將羥苯乙酯0.1 g 溶于乙醇5 g 中，逐漸加入，攪拌即可的透明凝膠；將冰片3 g 與薄荷油3 g 的混合液加入到透明凝膠中，再加入少量絲瓜水，涂布于無紡布上［5］，定型即得冷療凝膠基質(zhì)。黃芩冷療凝膠，將黃芩提取物10 g 與部分絲瓜水的混合液加入冷療凝膠基質(zhì)中，再加入適量絲瓜水，涂布于無紡布上，定型即得黃芩冷療凝膠。

2.2 造模及分組 參考文獻方法［6-7］，取大鼠，實驗前1 d以8%硫化鈉溶液左后肢脫毛。造模時腹腔注射10% 的水合氯醛麻醉大鼠，麻醉生效后，將大鼠俯臥位固定于自制軟組織打擊器上，并用紗布墊將左后肢墊起，以防其懸空。將左后肢稍外旋，用兩層薄紗片覆蓋大鼠的左大腿及臀部，緊接著將100 g 砝碼通過與砝碼直徑相當(dāng)?shù)乃芰瞎苤凶?0 cm 高處垂直自由落體沖擊大鼠大腿外側(cè)肌肉豐厚處，連續(xù)打擊5 次，造成打擊局部出現(xiàn)散在出血點，皮下瘀腫創(chuàng)面及腫脹的急性軟組織損傷模型。排除皮膚破損或骨折者。將造模成功的大鼠隨機分為6 組，每組8 只，分別為模型組、扶他林組、冷療凝膠基質(zhì)組、熱敷理療組、冷熱交替理療組及黃芩冷療凝膠組。另取8 只大鼠，只脫毛及麻醉，不造模，作為正常對照組。

2.3 給藥 全部大鼠待麻醉蘇醒后常規(guī)喂養(yǎng)，造模后24 h開始給藥；扶他林組直接涂抹扶他林；冷療凝膠基質(zhì)組黏貼冷療凝膠基質(zhì)；熱敷理療組以市售暖足理療貼熱敷5 min，間隔5 min，再重復(fù)，共2 h；冷熱交替理療組在患處先黏貼冷療凝膠基質(zhì)5 min，然后以市售暖足理療貼熱敷5 min，再在患處黏貼冷療凝膠基質(zhì)5 min，如此交替，共2 h；黃芩冷療凝膠組黏貼黃芩冷療凝膠；模型組、正常對照組不作處理。涂抹藥物及黏貼范圍均以瘀斑為中心約3 cm2，輔以透氣膠布固定。每日早晚各給藥1 次，連續(xù)5 d。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 損傷指數(shù)的測定 記錄造模后第1、3、5 天給藥前各組損傷指數(shù)。損傷指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)［8-9］：①皮下瘀血，多量塊狀計2 分，少量點狀計1 分，無瘀血者計0 分；②肌肉腫脹，明顯腫脹計2 分，稍有腫脹計1 分，無腫脹者計0分；③肌肉顏色，紫暗色深計2 分，暗紅色淺計1 分，色澤正常計0 分。

2.4.2 損傷組織中SOD 活性和MDA 水平的測定 于用藥后第6 天處死大鼠，取軟組織損傷區(qū)中心部位的肌肉組織用生理鹽水漂洗后濾紙吸干，稱質(zhì)量，每10 mg 組織加入1 mL生理鹽水，組織勻漿器內(nèi)充分勻漿，離心（3 000 r／min）20 min，收集上清液，采用比色法先測定組織蛋白量再測定勻漿液SOD 活性和MDA 水平，具體操作步驟嚴格按照蛋白定量測試盒、SOD 和MDA 試劑盒說明完成。

2.4.3 受損部位肌肉組織病理學(xué)檢查［10-11］取大鼠同一打擊部位、大小相等的組織塊，10% 甲醛固定，將標(biāo)本經(jīng)脫水處理后，石蠟包埋切片，HE 染色，光鏡下觀察細胞有無變性、壞死；肌肉間質(zhì)有無充血、水腫，炎細胞浸潤，纖維組織增生。

根據(jù)不同程度病理改變進行半定量測定，按病變由輕到重的程度依次定量為0～4 分，基本正常為0 分，輕微病變或極少量為0.5 分，輕度病變或少量為1 分，中度病變或較多為2 分，重度病變或多量為3 分，極重度病變或大量為4 分。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0 軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)均以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對ASTI 大鼠損傷指數(shù)的影響 大鼠造模后傷肢迅速腫脹，出現(xiàn)皮膚瘀斑及皮下出血，傷后24 h 各造模大鼠的病情評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，治療過程中各造模組的病情評分逐漸下降。至給藥后第3 天和第5 天同期扶他林組、冷療凝膠基質(zhì)組、冷熱交替理療組及黃芩冷療凝膠組與模型組比較，大鼠傷肢腫脹程度明顯減輕，瘀斑消退速度較快，損傷癥候指數(shù)評分均低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；熱敷理療組對ASTI 大鼠損傷指數(shù)無顯著性影響。見表1。

表1 對ASTI 大鼠損傷指數(shù)的影響（±s， n=8）

表1 對ASTI 大鼠損傷指數(shù)的影響（±s， n=8）

注：與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

3.2 對受損組織中SOD 活性及MDA 水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠在造模后其SOD 的活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，扶他林組、冷療凝膠基質(zhì)組、冷熱交替理療組和黃芩冷療凝膠組均能夠明顯升高損傷組織中的SOD 活性，且在給藥后，冷療凝膠基質(zhì)組和黃芩冷療凝膠組均能使大鼠肌肉組織中的SOD 恢復(fù)至接近正常組織的SOD 活性，熱敷理療組SOD 活性與模型組比較無顯著性差異。與正常對照組比較，模型組大鼠在造模后，其MDA 的水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，扶他林組、冷療凝膠基質(zhì)組、冷熱交替理療組和黃芩冷療凝膠組均能夠明顯降低損傷組織中的MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01），且在給藥后，黃芩冷療凝膠組能使MDA 水平逐漸恢復(fù)至接近正常組織的MDA 水平。見表2。

3.3 受損部位肌肉組織病理學(xué)檢查的結(jié)果 組織病理切片結(jié)果顯示，正常對照組大鼠肌細胞整齊有序，無變性、壞死；間質(zhì)無充血、水腫；無炎細胞浸潤，無成纖維細胞增生等病變。模型組大鼠肌細胞重度病變，間質(zhì)有輕度或中度炎細胞浸潤伴充血，部分有輕度至重度成纖維細胞增生。其他各給藥組肌肉病變較模型組均有所恢復(fù)，扶他林組間質(zhì)有少量炎細胞浸潤伴充血，部分有輕度成纖維細胞變性。冷療凝膠基質(zhì)組間質(zhì)充血減少，無成纖維細胞變性，但仍有輕微炎細胞浸潤。熱敷理療組間質(zhì)仍有輕度炎細胞浸潤并伴充血，有一定的成纖維細胞增生。冷熱交替理療組間質(zhì)有輕度炎細胞浸潤，無充血，無成纖維細胞增生。黃芩冷療凝膠組受損部位組織基本恢復(fù)正常，肌細胞恢復(fù)正常，間質(zhì)無炎細胞浸潤，無充血，無成纖維細胞增生。結(jié)果表明冷療凝膠基質(zhì)組能夠較好的減輕軟組織損傷的炎癥反應(yīng)及病理表現(xiàn)，黃芩冷療凝膠組對軟組織損傷具有顯著的治療作用，起效快、療效好，優(yōu)于扶他林組。見圖1。

表2 對大鼠受損組織中SOD 活性及MDA 水平的影響（±s， n=8）

表2 對大鼠受損組織中SOD 活性及MDA 水平的影響（±s， n=8）

注：與正常對照組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

圖1 對大鼠ASTI 組織病理學(xué)的影響（HE×100）

對組織病理切片進行評分，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肌肉病變明顯（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肌肉病變均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

4 討論

ASTI 是臨床常見病和多發(fā)病，它是指外力直接或間接作用于人體而引起軟組織的一系列病理變化的疾病。其病理變化以局部炎癥與修復(fù)為主要特征，臨床表現(xiàn)為局部腫脹與疼痛，還伴有不同程度血腫和瘀斑、肢體功能障礙等［12］。

表3 對ASTI 大鼠肌肉病變評分的影響（±s， n=8）

表3 對ASTI 大鼠肌肉病變評分的影響（±s， n=8）

注：與正常對照組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

凝膠劑是一種親水性大分子網(wǎng)狀體系，是一種載藥性能廣泛、藥物分散均勻的載藥平臺，具有含水量大、載藥量大、涂展性好、易于清洗、使用方便、體感舒適、透皮吸收性能好、生物相容性好等特點，適用于皮膚、黏膜及腔道給藥。中藥凝膠劑結(jié)合凝膠劑的特點與中藥外用治療特色，克服了傳統(tǒng)中藥外用制劑黏附性差、體感差、易致敏、患者接受度差的缺點，為中藥外用提供了一種良好的劑型［13］。

黃芩冷療凝膠主要由黃芩提取物、冰片、薄荷油、絲瓜水等組成，其中黃芩提取物為主藥，有抗炎、抗氧化、清熱解毒等作用，可對ASTI 起到主要治療作用；冰片，味辛苦，性微寒，具有開竅醒神、止癢、清熱止痛和抑菌的功效［14］，薄荷油具有清涼止癢、解痙、抗炎鎮(zhèn)痛等作用［15］，此二味藥均可為凝膠基質(zhì)提供冰感，同時起到基礎(chǔ)治療作用和促透作用；絲瓜水具有抗菌、消炎、抗氧化、補水、保濕等功效，具有豐富的生物活性物質(zhì)［16］，其替代傳統(tǒng)基質(zhì)制作過程中使用的蒸餾水，可被人體所吸收并發(fā)揮藥理作用。

理療是治療ASTI 的重要手段。常用的理療方法有冷療、熱療、冷熱交替療法。冷療適用于軟組織損傷的急性期，具有止血、止痛、減輕水腫、抑制損傷繼續(xù)發(fā)展等作用，同時還有減輕炎性反應(yīng)的作用［17］；熱療適用于軟組織損傷后期，可減輕肌肉緊張?zhí)弁?、改善局部循環(huán)、增強組織代謝、刺激組織再生；冷熱交替療法可有規(guī)律的刺激血管收縮與舒張，促進組織恢復(fù)，提高理療效果［18］。但是，上述理療方法受制于理療條件、理療操作手法與復(fù)雜程度及理療產(chǎn)品的質(zhì)量等因素，可能影響治療效果或帶來額外的凍傷或燙傷，給患者帶來不便。本項目開發(fā)的黃芩冷療凝膠，經(jīng)過實驗對比研究，發(fā)現(xiàn)其對ASTI 癥狀的消除、減輕病理改變等方面優(yōu)于單純的理療組及冷熱交替理療組，其可能的機制是通過增強SOD 活性，抑制MDA 的生成等抗氧化應(yīng)激途徑來發(fā)揮抗ASTI 的作用；其使用方便、體感舒適、配伍得當(dāng)，充分發(fā)揮中藥治療作用與冷療凝膠的理療功能，能更全面的照顧病情，達到良好的治療效果，提示有良好的應(yīng)用前景。