滕 鈺，薛詠蘭，黃 婕，羅 曼，王 俊，徐 洪

（貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽 550004）

貴州省是全國四大中藥產(chǎn)區(qū)之一，醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)也是其特色優(yōu)勢項目［1］，故保證微生物限度檢查方法的完整性與可靠性，是保障當(dāng)?shù)厮幤钒踩闹匾M成部分。同名異型中成藥是指名稱相同、劑型不同的中成藥［2］，貴州省食品藥品檢驗(yàn)所近年來相關(guān)研究涉及到7 組該類型，有的是同一藥企產(chǎn)品，有的為不同藥企生產(chǎn)。包擴(kuò)獨(dú)家品種民族藥、醫(yī)院制劑，劑型涉及到丸劑、膠囊、片劑、顆粒劑、洗劑、搽劑。現(xiàn)就上述藥品微生物限度檢查方法適用性研究過程及結(jié)果進(jìn)行分析。

1 材料

1.1 樣品 7 組樣品共涉及8 家生產(chǎn)企業(yè)，具體如下。

第1組：日舒安濕巾（批號 5076001、5076002、5076003）、日舒安洗液（批號 4066049、4066080、4066110），貴州漢方藥業(yè)有限公司。

第2組：婦科再造膠囊（批號1512003、2026008、2026012），貴州漢方藥業(yè)有限公司；婦科再造丸（批號11717053、11717054、11717062），貴州德昌祥藥業(yè)有限公司。

第3組：六味地黃膠囊（批號20170102、20170103、20170104），貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司；六味地黃丸（批號DCXA0401、DCXA0421、DCXA0532），貴州德昌祥藥業(yè)有限公司。

第4組：糖寧通絡(luò)膠囊（批號20170601、20170901、20171001）、糖寧通絡(luò)片（批號 20160401、20161201、20170901），貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司。

第5組：復(fù)方天麻顆粒（批號20170914、20170406、20170710），貴州科輝制藥有限責(zé)任公司；復(fù)方天麻片（批號20161003、20170301、20170702），貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司。

第6組：枇杷止咳顆粒（批號180313、180314、180315）、枇杷止咳膠囊（批號180402、180403、180404），貴州神奇藥業(yè)有限公司。

第7組：護(hù)肝寧片（批號 20180104、20180201、20180203），貴州信邦制藥股份有限公司；護(hù)肝寧膠囊（批號20160385、20180386、20160387），貴州益佰制藥股份有限公司。

其中，第1、2 組為獨(dú)家品種，第4 組為醫(yī)院制劑。

1.2 菌種 黑曲霉［CMCC（F）98003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、金黃色葡萄球菌 ［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、生孢梭菌［CMCC（B）64941］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、乙型副傷寒沙門菌［CMCC（B）50094］，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 試劑與培養(yǎng)基 吐溫-80（成都金山化學(xué)試劑，批號20170606）。梭菌增菌培養(yǎng)基（批號17070161）、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（批號1707171）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB（批號18030965）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA（批號18042762）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號17061281）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)（批號1512232）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA（批號18010864）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基SDB（批號18073161）、腸道增菌培養(yǎng)基（批號1609072）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號1610083）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號1703139）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號1604055）、木糖賴氨酸脫氧膽酸瓊脂（批號17050483），均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號3303081），購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 儀器 生物安全柜（美國NuAire 實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司，型號NU-425-400E）；低溫恒溫培養(yǎng)箱（型號KB240）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號BF240）（德國賓德公司）；立式自動壓力蒸汽滅菌器 ［致微（廈門）儀器有限公司，型號GR85DA］；電子天平（梅特勒-托利多國際有限公司，型號ME2002）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液制備 按2015 年版《中國藥典》四部通則1105［3］要求進(jìn)行制備。其中，日舒安洗液、咳速停糖漿取樣量為10 mL，日舒安濕巾取樣量為100 cm2，其余品種取樣量為10 g，分別加TSB 至100 mL，制成1∶10 供試液，再據(jù)品種實(shí)際情況選擇合適稀釋倍數(shù)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。

2.2 菌液制備 按2015 年版 《中國藥典》四部通則1105、1106［3］要求進(jìn)行制備。

2.3 回收比值計算 計數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，回收比值=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）／菌液對照組菌落數(shù)［3］，添加中和劑組的中和劑回收比值=（中和劑對照組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）／菌液對照組菌落數(shù)［4］。2015 年版《中國藥典》［3］規(guī)定，回收比值應(yīng)在0.5～2 之間，本實(shí)驗(yàn)將其下限提升至0.7 左右，以保證該方法在之后日常檢驗(yàn)中重復(fù)性更佳。

2.4 計數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.4.1 分組 試驗(yàn)組，按要求在供試液加入“2.2”項下菌液，使每1 mL 供試液中的加菌量不大于100 cfu，混勻；供試品對照組，取供試液，以TSB 代替菌液，其他同試驗(yàn)組；菌液對照組，取TSB 替代供試液，其他同試驗(yàn)組；中和劑對照組，取含1%吐溫-80 的TSB 代替供試液，其他同試驗(yàn)組。以上4 組均取1 mL 混合液，置于90 mm 培養(yǎng)皿中，需氧菌總數(shù)計數(shù)對應(yīng)組加入20 mL TSA 培養(yǎng)基，霉菌、酵母菌計數(shù)對應(yīng)組加入20 mL SDA 培養(yǎng)基，分別放至34、23 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、5 d，計數(shù)記錄。

2.4.2 預(yù)試驗(yàn) 據(jù)藥品品種成分［5-24］及企業(yè)反饋信息，分別在合適稀釋倍數(shù)下選擇各品種對應(yīng)的敏感菌株進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 預(yù)試驗(yàn)回收比值

由表可知，第1 組樣品對枯草芽孢桿菌抑制較強(qiáng)，當(dāng)稀釋倍數(shù)到1∶40 時回收比值能達(dá)到要求，但其為陰道給藥，計數(shù)限度較低，故考慮添加中和劑以消除供試品抑菌活性，減小稀釋倍數(shù)。第2 組樣品中，丸劑對白色念珠菌有抑制作用，對需氧菌、霉菌和酵母計數(shù)方法需分別擴(kuò)大稀釋倍數(shù)至1∶40、1∶20。第3 組中丸劑對枯草芽孢桿菌抑菌性很強(qiáng)，1∶10 時回收比值為0，稀釋倍數(shù)為1∶100時能消除抑菌性。在稀釋倍數(shù)為1∶50 時，第4 組樣品對枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的抑菌性消除效果好；在需氧菌、霉菌和酵母計數(shù)方法考察中，對白色念珠菌的稀釋倍數(shù)分別為1∶100、1∶80 時可很好地消除抑菌性。第7組中片劑和膠囊的稀釋倍數(shù)分別為1∶100、1∶200 時，能較好消除對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑制作用。

然后，采用含1%吐溫-80 的TSB 作為稀釋液，對第1組樣品進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果見表2，可知吐溫-80 可有效消除該品種對3 株菌的抑菌作用，而且對試驗(yàn)菌的生長無明顯影響。再通過預(yù)試驗(yàn)回收比值結(jié)果確定供試液稀釋倍數(shù)，見表3。

表2 日舒安洗液、日舒安濕巾添加中和劑預(yù)試驗(yàn)回收比值

表3 計數(shù)方法稀釋倍數(shù)

2.4.3 正式試驗(yàn) 根據(jù)表3 中的稀釋倍數(shù)，進(jìn)行各品種3個批次計數(shù)方法的適用性試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表可知，除六味地黃膠囊的金黃葡萄球菌回收比值稍低外，其余品種均基本在0.7 以上，表明該計數(shù)方法能較好地保證其重復(fù)性，方法可行。另外，結(jié)合表3～4 可知，第1、4～6 組內(nèi)樣品計數(shù)方法一致，而第2～3、7 組內(nèi)樣品計數(shù)方法不同。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2.5.1 檢查項目與方法 按照2015 年版《中國藥典》四部通則1106、1107 規(guī)定［3］，以給藥途徑和是否含藥材原粉為指標(biāo)確定了控制菌檢查項目：陰道給藥制劑需控制金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和生孢梭菌，固體口服制劑均需控制大腸埃希菌，含藥材原粉的還需控制沙門氏菌和耐膽鹽革蘭陰性菌。根據(jù)7 組樣品情況，參照黎春彤［25］、李力等［26］報道的方法，結(jié)合藥典規(guī)定，在規(guī)定溫度和最短時間下培養(yǎng)，以期檢出所加試驗(yàn)菌相應(yīng)的反應(yīng)特征［3］。

表4 各品種計數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 結(jié)果分析 當(dāng)培養(yǎng)基體積如表5 所示時，能檢出相應(yīng)陽性對照菌，表明該方法可行。其中，第1 組樣品需培養(yǎng)基稀釋法才能去除抑菌作用；第2 組樣品需采用培養(yǎng)基稀釋法才能檢出沙門氏菌和耐膽鹽革蘭陰性菌陽性對照菌；第3 組膠囊劑對大腸埃希菌和沙門氏菌的抑制作用較丸劑弱，但其耐膽鹽革蘭陰性菌需采用比同組丸劑更大的培養(yǎng)基稀釋倍數(shù)才能消除對陽性對照菌的抑制；第7 組樣品采用培養(yǎng)基稀釋法檢查沙門氏菌；其余組別樣品控制菌用常規(guī)方法即可檢出。

3 討論

方法適用性試驗(yàn)的本質(zhì)是建立對樣品影響更小、操作得率更高的方法［27］，但其本身工作量大，而且存在不同實(shí)驗(yàn)室方法欠佳、重復(fù)勞動過多的問題［28］，去除藥品抑菌性是其中的重點(diǎn)和難點(diǎn)［29］。因此，本實(shí)驗(yàn)在研究前對樣品組分抑菌性進(jìn)行分析以確定預(yù)試驗(yàn)菌株，再根據(jù)藥典對不同給藥途徑的限度規(guī)定，確定最終的計數(shù)方法；對控制菌檢查法，主要結(jié)合給藥途徑、是否含藥材原粉2 個方面來開展研究，能有效提高方法適用性試驗(yàn)的效率。

表5 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

由于中藥材品種繁多、臨床要求不同、藥材所含成分之間相互作用關(guān)系復(fù)雜等原因，需將藥材制成各種不同劑型以滿足用藥需要［30］。本實(shí)驗(yàn)中7 組同名異型中成藥原藥材、功能主治一致，但由于劑型不同，其生產(chǎn)工藝與輔料會有所差異，最終導(dǎo)致抑菌活性的區(qū)別。劉康連等［31］曾對同一企業(yè)生產(chǎn)的5 組含藥材原粉的同名異型中藥制劑進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性研究，發(fā)現(xiàn)均存在方法差異；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含藥材原粉的不同劑型中成藥微生物限度檢查方法均不一致，尤其在計數(shù)方法上的差別較明顯，這與前期報道結(jié)果一致；對于不含藥材原粉的不同劑型中成藥，雖然某些試驗(yàn)菌回收比值存在差異，但即使不屬于同一企業(yè)生產(chǎn)，也可以做到方法統(tǒng)一。