張璟璇，袁美春，李海霞，張志鋒

（湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，湖北 十堰 442000）

人參是我國珍貴的傳統(tǒng)中藥，具有活血、安神等多種功效。人參皂苷Rb1是人參藥理作用的主要成分之一，相關(guān)研究表明其對帕金森模型小鼠［1］、脊髓損傷大鼠［2-3］及受損海馬神經(jīng)元［4-5］均具有一定的保護作用。

缺血性腦卒中是一種因腦部血液循環(huán)障礙引起的腦組織壞死疾病，其發(fā)病機制比較復(fù)雜，包括自由基損傷、細胞凋亡以及炎癥反應(yīng)等［6-7］。臨床上尚缺乏有效治療措施，因此探索我國傳統(tǒng)中草藥在腦卒中防治方面的應(yīng)用具有重要意義。本研究經(jīng)氧糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)建立大鼠原代皮層神經(jīng)元損傷模型，觀察人參皂苷Rb1對受損神經(jīng)元凋亡的影響，并對其機制進行初步探索。

1 材料

1.1 動物 由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實驗中心提供SPF 級SD 孕鼠，實驗動物使用許可證號SYXK（鄂）2016-0031。

1.2 試藥 人參皂苷Rb1購自美國MCE 公司（MedChem Express，Lot No＃19021）；PI3K／Akt 通路抑制劑LY294002 購自美國Cell Signaling Technology 公司；p-Akt（Ser 473）、t-Akt 一抗抗體均購自美國Santa Cruz 公司。

2 方法

2.1 原代大鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng) 方法如前期報道所述［8-9］，將SD 孕鼠麻醉、頸椎脫臼處死后，迅速切開腹部皮膚，取出胎鼠，斷頭，除腦膜，分離、剪碎腦皮層組織，重懸入原代神經(jīng)元培養(yǎng)液，再用濾網(wǎng)過濾，得到大腦單層細胞懸液，最后將神經(jīng)元放入細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每隔3 d 換無FBS 神經(jīng)元培養(yǎng)液1 次，培養(yǎng)12 d 后可進行其他實驗。

2.2 建模 將神經(jīng)元置于三氣培養(yǎng)箱（85% N2、10%H2、5%CO2混合氣體）中用無糖細胞外液中培養(yǎng)1.5 h，構(gòu)建OGD，然后將神經(jīng)元恢復(fù)放置正常的無菌細胞培養(yǎng)箱中，用新的神經(jīng)元維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3 分組、給藥 人參皂苷Rb1用DMSO 溶解成濃度為5 mmol／L 的母液，使用前由PBS 來稀釋。用不同濃度人參皂苷Rb1（0 nmol／L、200 nmol／L、2 μmol／L、20 μmol//L）提前1 h 預(yù)處理神經(jīng)元，然后經(jīng)OGD、復(fù)氧損傷處理，分為5 組：①對照組（無OGD 損傷處理，細胞進行正常培養(yǎng)處理）；②模型組（OGD+溶劑）；③人參皂苷Rb1200 nmol／L組（OGD+200 nmol／L 人參皂苷Rb1）；④人參皂苷Rb12 μmol／L 組（OGD+2 μmol／L 人參皂苷Rb1）；⑤人參皂苷Rb120 μmol／L 組（OGD+20 μmol／L 人參皂苷Rb1）。

為了進一步研究人參皂苷Rb1作用機制，首先用1 μmol／L LY294002 提前處理神經(jīng)元，30 min 后加入20 μmol／L 人參皂苷Rb1，1 h 后再進行如上所述OGD 和復(fù)氧損傷處理，共4 組，具體分組如下：①對照組；②模型組（OGD+溶劑）；③人參皂苷Rb1組（OGD+20 μmol／L 人參皂苷Rb1）；④人參皂苷Rb1+LY294002 組（OGD+20 μmol／L人參皂苷Rb1+1 μmol／L LY294002）。

2.4 LDH 釋放測定 細胞以1×105／mL 密度種于96 孔板中，當(dāng)細胞密度達90%時開始實驗，具體步驟參照CytoTox 96 細胞毒性試劑盒說明書所述，在酶聯(lián)檢測儀上測定各孔的光密度（OD），檢測波長492 nm。LDH 釋放=［（實驗組OD-總自然釋放OD）／（最大釋放組OD-總自然釋放OD）］×100%。

2.5 Western blot 藥物處理24 h 的各組神經(jīng)元蛋白用BCA 法測各組蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE 電泳、PVDF 膜轉(zhuǎn)膜、5% 脫脂奶粉封閉后孵一抗（p-Akt、t-Akt，1∶1 000），4 ℃過夜，次日于室溫孵二抗2 h，最后用ECL 發(fā)光試劑盒顯影。

2.6 PI／FDA 染色值測定 采用碘化丙啶（PI）和二乙酸熒光素（FDA）雙染法檢測神經(jīng)元凋亡。神經(jīng)元用FDA（5 μmol／L）和PI（2 μmol／L）2種染液共孵育30 min 后，在熒光顯微鏡下觀察。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 16.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析和雙因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rb1對OGD 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷活性的影響 如圖1 所示，與模型組比較，人參皂苷Rb1（2、20 μmol／L）顯著減少LDH 的釋放（P＜0.05），20 μmol／L 效果更優(yōu)，所以選擇20 μmol／L作為人參皂苷Rb1在后續(xù)實驗中的最適濃度。

3.2 人參皂苷Rb1對OGD 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷凋亡的影響 如圖2 所示，與對照組比較，模型組PI染色神經(jīng)元與FDA 染色神經(jīng)元的比值顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rb1組（2、20 μmol／L）PI 染色神經(jīng)元與FDA 染色神經(jīng)元的比值顯著減?。≒＜0.05），說明2、20 μmol／L 人參皂苷Rb1可降低神經(jīng)元的凋亡率。

圖1 人參皂苷Rb1對神經(jīng)元損傷活性的影響Fig.1 Effects of ginsenoside Rb1on neuronal injury activity

圖2 人參皂苷Rb1對神經(jīng)元凋亡的影響Fig.2 Effects of ginsenoside Rb1on neuronal apoptosis

3.3 人參皂苷Rb1對OGD 誘導(dǎo)的損傷神經(jīng)元p-Akt（Ser473）表達的影響 如圖3 所示，與模型組比較，人參皂苷Rb1（0.2、2、20 μmol／L）可顯著提高神經(jīng)元p-Akt 表達（P＜0.05）；1 μmol／L LY294002 預(yù)處理后與人參皂苷Rb1（20 μmol／L）組比較，人參皂苷Rb1+LY294002 組可顯著降低p-Akt 表達（P＜0.05）。

3.4 人參皂苷Rb1對經(jīng)LY294002 預(yù)處理的OGD損傷神經(jīng)元活性的影響 如圖4 所示，與模型組比較，人參皂苷Rb1組（20 μmol／L）可顯著降低LDH 釋 放（P＜0.05）；與 人 參 皂 苷 Rb1組（20 μmol／L）比較，人參皂苷Rb1+LY294002 組可顯著提高LDH 釋放（P＜0.05）。

3.5 人參皂苷Rb1對經(jīng)LY294002 預(yù)處理的OGD損傷神經(jīng)元凋亡的影響 如圖5 所示，與模型組比較，人參皂苷Rb1組（20 μmol／L）可顯著降低PI染色神經(jīng)元與FDA 染色神經(jīng)元的比值（P＜0.05）；與人參皂苷Rb1組（20 μmol／L）比較，人參皂苷Rb1+LY294002 組可顯著提高PI 染色神經(jīng)元與FDA 染色神經(jīng)元的比值（P＜0.05）。

4 討論

人參皂苷Rb1是我國珍貴中藥人參的主要成分，參與調(diào)節(jié)機體多種生化反應(yīng)，如可減輕神經(jīng)元興奮毒性作用，減弱氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，抗凋亡等［10］，尤其是對脊髓神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元等多種神經(jīng)元損傷均具有一定的保護作用［1-5］。因此，人參皂苷Rb1在臨床應(yīng)用方面具有良好的前景。本實驗以SD 大鼠原代皮層神經(jīng)元為研究對象，用OGD 損傷模型來研究人參皂苷Rb1在缺血性腦卒體外實驗中的作用及初步機制。

圖3 人參皂苷Rb1對神經(jīng)元p-Akt 表達的影響Fig.3 Effects of ginsenoside Rb1on p-Akt expression in neurons

圖4 LY294002 對人參皂苷Rb1抑制LDH 釋放的影響Fig.4 Effects of LY294002 on inhibition of LDH release by ginsenoside Rb1

首先用不同濃度人參皂苷Rb1預(yù)處理神經(jīng)元，1 h 后再經(jīng)OGD 損傷處理神經(jīng)元1.5 h，24 h 后檢測各組神經(jīng)元活性變化，顯示200 nmol／L 人參皂苷Rb1對神經(jīng)元活性無影響，而達到2 μmol／L 以上時可降低神經(jīng)元LDH 釋放量，并能減少神經(jīng)元凋亡率，達到20 μmol／L 時效果更顯著，故選擇20 μmol／L 濃度進一步深入研究。以上結(jié)果表明，人參皂苷Rb1可降低OGD 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

大量文獻報道，PI3K／Akt 通路可調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、凋亡、遷移、分化以及炎癥反應(yīng)等過程［11-17］。相關(guān)研究證實［8-9，18］，在動物大腦中動脈阻塞損傷模型和氧糖剝奪細胞損傷模型中，神經(jīng)元p-Akt（Ser473）表達水平均被抑制；本研究也同樣檢測到大鼠原代皮層神經(jīng)元在OGD 損傷條件下其p-Akt（Ser473）表達水平顯著下調(diào)，間接提示上調(diào)神經(jīng)元p-Akt（Ser473）水平可能對神經(jīng)元具有保護作用。有研究證實［19］，神經(jīng)元在缺氧損傷條件下，激活PI3K／Akt 信號通路可對神經(jīng)元起一定保護作用；本研究結(jié)果也顯示，神經(jīng)元經(jīng)人參皂苷Rb1處理后可將其p-Akt（Ser473）表達水平上調(diào)，并且當(dāng)其濃度上調(diào)到20 μmol／L 時，神經(jīng)元p-Akt（Ser473）水平上調(diào)更顯著。p-Akt（Ser473）水平的升高可代表PI3K／Akt 通路活性的激活。以上結(jié)果表明，人參皂苷Rb1降低OGD 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡可能與PI3K／Akt 通路激活相關(guān)。

圖5 LY294002 對人參皂苷Rb1抑制神經(jīng)元凋亡的影響Fig.5 Effects of LY294002 on inhibition of neuronal apoptosis by ginsenoside Rb1

LY294002 為常用的PI3K 拮抗劑，可有效抑制PI3K／Akt 信號通路活性［20］。為進一步驗證人參皂苷Rb1是否經(jīng)PI3K／Akt 信號通路對OGD 損傷神經(jīng)元發(fā)揮保護作用，將1 μmol／L LY294002 用于本研究中，結(jié)果表明，LY294002 和人參皂苷Rb1共處理神經(jīng)元較人參皂苷Rb1單獨處理神經(jīng)元提高了神經(jīng)元LDH 的釋放量和神經(jīng)元的凋亡率，表明人參皂苷Rb1可通過PI3K／Akt 通路對OGD 損傷的大鼠原代皮層神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。由此表明，人參皂苷Rb1可經(jīng)激活PI3K／Akt 信號通路來抑制OGD 誘導(dǎo)的大鼠原代皮層神經(jīng)元凋亡。

本實驗創(chuàng)新之處在于首次將人參皂苷Rb1應(yīng)用于大鼠原代皮層神經(jīng)元在OGD 損傷模型中來，初步研究了該成分對腦卒中細胞模型實驗的作用效果及初步作用機制。不足之處在于一方面是沒有加入動物模型實驗來進一步確定人參皂苷Rb1對實驗動物的作用效果；另一方面是沒有進一步探索人參皂苷Rb1發(fā)揮神經(jīng)保護作用的作用機制，因為在此模型中Akt 分子的上下游分子可能是哪些，哪些分子作用機制參與了人參皂苷Rb1對神經(jīng)元的保護作用尚不確定，以上都是在今后要進一步開展和完善的部分。