鄭丹丹，李福帥，張 超，張立華，呂 慧，王占一，王京龍?

（1.棗莊學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355）

前期報(bào)道，超聲輔助提取技術(shù)被廣泛用于柿蒂中齊墩果酸、熊果酸的提?。?，9］；微波輔助萃取技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，作為新技術(shù)也在中藥活性成分提取中得到了成功應(yīng)用［10-11］，但尚無(wú)提取上述2 種成分的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)柿蒂中齊墩果酸、熊果酸的微波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為后續(xù)研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，也為相關(guān)資源開(kāi)發(fā)提供借鑒。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；XH-200A 電腦微波固液相合成／萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；UV-4802 雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) ［尤尼柯（上海）儀器有限公司］；MF-1000 小型薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（山東愛(ài)博科技貿(mào)易有限公司）。柿蒂購(gòu)自棗莊市天天好醫(yī)藥連鎖有限公司，經(jīng)棗莊學(xué)院李思健教授鑒定為柿樹(shù)科植物柿Diospyros kakiThunb.的干燥宿萼。熊果酸（批號(hào)20160810，含有量≥98%）、齊墩果酸（批號(hào)20180320，含有量≥98%）對(duì)照品（上海如吉生物科技有限公司）。冰乙酸、乙酸銨為分析純（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；高氯酸為分析純（天津市鑫源化工有限公司）；香草醛為分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇、乙腈為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總?cè)坪辛繙y(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)定取熊果酸對(duì)照品適量，甲醇稀釋并定容至100 mL，即得（0.1 mg／mL）。

2.1.2 供試品溶液制備［12］取適量藥材粗粉（過(guò)40 目篩）置于索式提取器中，石油醚（60～90 ℃）脫脂1.5 h，取出晾干，稱(chēng)取5 g，按一定料液比加入適量提取劑，置于微波合成萃取儀中，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)奈⒉▍?shù)進(jìn)行提取，結(jié)束后過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，將洗滌容器和殘?jiān)囊掖紴V液合并，少量乙醇定容至刻度，搖勻，即得（0.05 g／mL）。

2.1.3 吸光度測(cè)定 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液0.50 mL，置于10 mL 具塞試管中，60 ℃水浴蒸干，精密加入新配制的5% 香草醛-冰醋酸0.30 mL、高氯酸1.00 mL，60 ℃水浴15 min，移入冰水浴中冷卻至室溫，再加入5.00 mL 冰醋酸搖勻，15 min 后于548 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.1.4 方法學(xué)考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A=47.837X+0.004 4（R2=0.999 0），在0.004 76～0.012 7 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。另外，儀器精密度RSD 為0.8%；重復(fù)性RSD 為1.69%；反應(yīng)后2 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD 為2.0%；平均加樣回收率為103.60%，RSD 為2.8%。綜上所述，方法學(xué)驗(yàn)證符合相關(guān)要求。

2.2 齊墩果酸、熊果酸含有量測(cè)定

花芽被害后，嚴(yán)重者花蕾不能開(kāi)放，萎縮枯死。輕者被害花萼片和花梗畸形，花瓣狹長(zhǎng)，色淡綠，在花萼洼或梗洼處產(chǎn)生白色粉斑。受害花的雌、雄蕊失去作用，不能授粉坐果，最后干枯死亡。

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品適量，甲醇稀釋并定容至50 mL，即得（0.1、0.2 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液制備 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得（0.05 g／mL）。

2.2.3 色譜條件 Hypersil ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.2% 乙酸銨（85∶ 15）；體積流量0.6 mL／min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量20 μL，色譜圖見(jiàn)圖1。理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)均大于8 000，分離度均大于1.7。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.4 方法學(xué)考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，定容至10 mL，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得齊墩果酸、熊果酸方程分別為Y=16 740X+93.767（R2=0.999 8）、Y=16 248X-40.8（R2=0.999 6），分別在0.01～0.06、0.02～0.12 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。齊墩果酸精密度RSD 為1.25%；重復(fù)性RSD 為1.6%；16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD 為1.6%；平均加樣回收率為99.75%，RSD 為1.28%，而熊果酸精密度RSD 為0.96%；重復(fù)性RSD 為1.7%；16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD 為1.2%；平均加樣回收率為101.5%，RSD 為0.98%。綜上所述，方法學(xué)驗(yàn)證符合相關(guān)要求。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比 取脫脂后藥材粉末5 g，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，微波功率650 W，微波時(shí)間6 min，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)得料液比1∶20、1∶24、1∶28、1∶32、1∶36 下總?cè)频寐史謩e為0.37%、0.44%、0.48%、0.43%、0.39%。由此可知，該成分得率隨著料液比增大呈先上升后下降趨勢(shì)，在1∶28時(shí)最高，而在1∶20、1∶36 時(shí)較小，故選擇1∶24、1∶28、1∶32 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 取脫脂后藥材粉末5 g，固定料液比1∶20，微波功率650 W，微波時(shí)間6 min，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)得乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90% 下總?cè)频寐史謩e為0.35%、0.45%、0.46%、0.43%、0.40%。由此可知，該成分得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大呈先上升后下降趨勢(shì)，在60%、70%、80%時(shí)較高，其中70%時(shí)最高，故選擇60%、70%、80%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3.3 微波時(shí)間 取脫脂后藥材粉末5 g，固定料液比1∶20，微波功率650 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)得微波時(shí)間4、5、6、7、8 min 下總?cè)频寐史謩e為0.37%、0.45%、0.46%、0.44%、0.38%。由此可知，該成分得率隨著微波時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，在5、6、7 min 時(shí)較高，其中7 min 時(shí)最高，故選擇5、6、7 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3.4 微波功率 取脫脂后藥材粉末5 g，固定料液比1∶20，微波時(shí)間6 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)得微波功率450、550、650、750、850 W 下總?cè)频寐史謩e為0.33%、0.39%、0.47%、0.37%、0.34%。由此可知，該成分得率隨著微波功率增大呈先上升后下降趨勢(shì)，在450 W 時(shí)較低，升至850 W 時(shí)又明顯下降，故選擇550、650、750 W 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、微波時(shí)間（C）、微波功率（D）為影響因素，齊墩果酸得率（Y1）、熊果酸得率（Y2）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)Design Expert V.8.0.6 軟件設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1［11］，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

然后，通過(guò)Design-Expert V.8.0.6 軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得回歸方程分別為Y1=0.16+5.833×10-3A-0014B+0.010C+0.025D+0.020AC+0.026BC+0.018CD-0.071A2-0.032B2-0.018C2-0.030D2、Y2=0.36-4.167×10-4A-0.017B+0.014C+0.029D-1.250×10-3AB+0.029AC-5.250×10-3AD+0.025BC+2.000 ×10-3BD+0.021CD-0.087A2-0.038B2-0.024C2-0.037D2。

齊墩果酸得率方差分析見(jiàn)表3，可知回歸模型高度顯著（F=13.79，P＜0.000 1），失擬項(xiàng)P=0.123 8 ＞0.05，表明模型擬合度較好；D、BC、A2、B2、D2有極顯著影響（P＜0.01），B、AC、C2有顯著影響（P＜0.05），各因素影響程度依次為D＞B＞C＞A。熊果酸得率方差分析見(jiàn)表4，可知回歸模型高度顯著（F=20.93，P＜0.000 1），失擬項(xiàng)P=0.091 1 ＞0.05，表明模型擬合度較好；B、C、D、AC、BC、A2、B2、C2、D2有極顯著影響（P＜0.01），CD 有顯著影響（P＜0.05），各因素影響程度依次為D＞B＞C＞A。響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2～3。

表3 齊墩果酸得率方差分析Tab.3 Analysis of variance for oleanolic acid yield

表4 熊果酸得率方差分析Tab.4 Analysis of variance for ursolic acid yield

圖2 各因素響應(yīng)面圖（齊墩果酸得率）Fig.2 Response surface plots for various factors（oleanolic acid yield）

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert V.8.0.6 軟件進(jìn)行分析，得到齊墩果酸最優(yōu)提取工藝為料液比1∶28.37，乙醇體積分?jǐn)?shù)71.65%，微波時(shí)間6.78 min，微波功率713.29 W，得率0.167%；熊果酸最優(yōu)提取工藝為料液比1∶28，乙醇體積分?jǐn)?shù)69.80%，微波時(shí)間6.56 min，微波功率700 W，得率0.369%，可知2 種成分工藝參數(shù)非常接近，考慮到可操作性，將兩者統(tǒng)一調(diào)整為料液比1∶28，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，微波時(shí)間6.5 min，微波功率700 W。然后，取脫脂后藥材粉末5 g，按照優(yōu)化工藝進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5，可知工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

微波輔助提取法能大大提高效率，由常規(guī)的1～2 h 降低到6～7 min，可為齊墩果酸、熊果酸提取工藝優(yōu)化降低成本。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各因素對(duì)成分得率的影響程度依次為微波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波時(shí)間＞料液比。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of verification tests（n=3）

由于齊墩果酸和熊果酸為一對(duì)同分異構(gòu)體，化學(xué)性質(zhì)相近，故兩者最優(yōu)提取工藝也非常相似，可高效地同時(shí)提取兩者。同時(shí)，HPLC 分析時(shí)在流動(dòng)相中加入0.2% 乙酸銨［13］，可起到反相離子對(duì)作用，從而改善上述2 種成分的分離效果［14］，并且其理論塔板數(shù)均大于8 000，分離度達(dá)到1.7，符合含有量測(cè)定要求。2015 年版《中國(guó)藥典》中柿蒂尚無(wú)藥效成分定量控制的規(guī)定，而本方法簡(jiǎn)便可行，可為相關(guān)方法的建立提供借鑒。

圖3 各因素響應(yīng)面圖（熊果酸得率）Fig.3 Response surface plots for various factors（ursolic acid yield）