阮宇 文鋮 趙雪雷 王現(xiàn)蕾 程曉華 趙麗萍 張偉 黃麗輝

首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院，北京市耳鼻咽喉科研究所，耳鼻咽喉頭頸外科學教育部重點實驗室（100005北京）

新生兒聽力損失是常見的出生缺陷之一，其發(fā)病率為1‰～3‰，位于目前篩查的幾種新生兒疾病之首[1-3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約有4.66億人患有殘疾性聽力損失，超過了世界人口的5%，其中3400萬是兒童。除非采取行動，否則到2030年將有近6.3億人罹患殘疾性聽力損失，到2050年，可能會增加到9億人以上。聽力損失病因?qū)W研究顯示，大約60%的耳聾患者與遺傳因素有關，遺傳因素導致的聽力損失在兒童聽力損失患者中高達50%～60%以上[4,5]。2012年，北京市在全國率先開展了新生兒耳聾基因篩查工作，使新生兒遺傳性聾患者及耳聾基因攜帶者得到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預，取得了良好的社會效應。耳聾基因診斷對明確耳聾病因、預防耳聾發(fā)生有著重要意義，國內(nèi)學者于2019年驗證了新生兒耳聾基因篩查能夠有效提高聽力損失患兒的檢出效能[6,7]。本研究旨在對北京地區(qū)新生兒常見耳聾基因篩查的突變情況進行分析，了解純合∕復合雜合突變者的聽力情況、干預時間及干預效果。

1 對象與方法

1.1 研究對象

北京地區(qū)2012年4月～2014年4月期間出生、監(jiān)護人簽署知情同意書、并接受了耳聾基因篩查的新生兒75649例。

1.2 新生兒耳聾基因篩查

1.2.1 采血方法

由助產(chǎn)機構專業(yè)人員在新生兒出生后3天內(nèi)采集足跟末梢血2個血斑，制成濾紙干血片，每個血斑直徑不小于8mm。

1.2.2 提取DNA

采用打孔器得到3mm直徑的干血斑，應用口腔拭子基因組DNA提取試劑盒（天根DP322，北京）提取DNA，用紫外分光光度計（美國分子生物的SPECTRA max plus）檢測DNA濃度與純度，其最低濃度應滿足工作濃度2ng∕μl。

1.2.3 芯片檢測

本研究應用晶芯?九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（博奧生物300065，北京）檢測GJB2(c.235delC、c.299_300delAT、c.176_191dell6、c.35delG）、SLC26A4（c.919-2A＞G、c.2168A＞G）、GJB3(c.538C＞T)、線粒體12SrRNA(m.1555A＞G、m.1494C＞T)。用 DNA 作為模板，采用帶有Tag標簽序列的基因位點特異性引物對相關基因位點所在的基因片段進行擴增及熒光標記，然后與能識別相應標簽序列的通用基因芯片進行雜交，最后通過對芯片進行掃描及數(shù)據(jù)分析，得到被檢測的9個位點的結果。由于針對所檢測的9個位點的野生型和突變型分別設計了引物和探針，因此本試劑盒可同時檢測9個位點的野生型（陰性）和突變型（陽性）結果。主要設備包括：PCR儀（S1000PCR儀，Bio-Rad）、芯片雜交儀、芯片洗干儀及晶芯?LuxScan?10K-B微陣列芯片掃描儀。

1.3 新生兒聽力篩查

本研究使用的耳聲發(fā)射儀為MADSEN公司的Capella，行瞬態(tài)誘發(fā)耳聲發(fā)射(TEOAE)測試。篩查模式包括院內(nèi)兩步篩查及兩步復篩，院內(nèi)兩步篩查即出生后48小時內(nèi)在本底噪聲＜40 dB(A)的隔聲室中進行初篩，對初篩未通過且住院時間超過72小時的新生兒進行第二次篩查。兩步復篩即未通過院內(nèi)篩查者分別于42天和／或2.5月齡時接受復篩。TEOAE測試的刺激聲為短聲(click)，刺激強度為70～75 dB SPI，信號疊加次數(shù)為500～2080次。TEOAE測試的通過標準為總反應強度大于或等于10 dB SPL，反應波的重復率大于或等于50%，3個以上分析頻率信噪比大于或等于3 dB。

1.4 診斷性聽力學檢測

未通過復篩者，于出生后3個月進行診斷性聽力學檢測。

1.4.1 聲導抗測試

應用美國的GSI-Tympstar中耳分析儀，探測音頻率為226 Hz和1 k Hz，強度為85 dB SPL，外耳道壓力從+200daPa向-400daPa方向變化，壓力變化速率為50daPa∕s。測試時選擇合適的探頭，使其與耳道口密閉良好。226Hz探測音鼓室圖根據(jù)Liden-Jerger分型對鼓室圖進行分類：A型（包括As和Ad兩個亞型）、B型和C型。根據(jù)有無峰及峰的數(shù)目將鼓室圖分為單峰型、雙峰型及平坦型。

1.4.2 ABR測試

采用美國Nicolet公司生產(chǎn)的Spirit誘發(fā)電位儀，于符合國家標準的電屏蔽隔聲室進行。根據(jù)小兒體重服用一定量6.5%水合氯醛溶液，于睡眠狀態(tài)下測試。刺激聲為交替極性的短聲(click)，脈寬0.1ms，刺激聲起始強度80dB nHL，刺激重復率19.9次∕s，分析時間12 ms，帶通濾波100～3000 Hz，疊加次數(shù)1000次。電極：前額為記錄電極，聲刺激側乳突為參考電極，眉間為接地電極。

1.4.3 DPOAE測試

使用英國Otodynamics公司生產(chǎn)的IL092型耳聲發(fā)射儀，測試條件：同時使用2個刺激純音f1、f2，強度fl=f2=70 dB，f2:fl=1.22；刺激聲岔的頻率點為696、1001、1501、2002、3003、4004、5005 和 6006 Hz。DPOAE的正常標準：每個分析頻率點畸變產(chǎn)物(distortion product，DP)的值在正常范圍內(nèi)，同時該頻率點的幅值大于該點噪聲6 dB。

1.4.4 ASSR測試

應用丹麥Eclipse ASSR誘發(fā)電位儀，于符合國家標準的電屏蔽隔聲室進行。采用ASSR常規(guī)參數(shù)設置，刺激聲頻率為：0.5kHz、1kHz、2kHz及4kHz。根據(jù)小兒公斤體重服用一定量10%水合氯醛溶液，于睡眠狀態(tài)下測試。

1.4.5 小兒行為測聽

應用丹麥爾聽美Conera純音聽力計，插入式耳機ER-3A。在符合國家標準即環(huán)境噪聲＜20dB(A)的隔聲室進行。根據(jù)嬰幼兒年齡及發(fā)育狀況選擇行為觀察測聽(behavioral observation audiometry,BOA)、視覺強化測聽(visual reinforcement audiometry,VRA)、游戲測聽(play audiometry,PA)。測試中測試者和誘導觀察者相互配合，使小兒建立良好的條件反射，獲得小兒行為聽閾。

1.4.6 聽力損失程度分級

按照WHO(1997)制定標準[8]，以小兒行為測聽氣導0.5kHz,1kHz,2kHz,4 kHz平均聽閾評估聽力損失程度分級。輕度聽力損失：26～40dB HL，中度聽力損失：41～60dB HL，重度聽力損失：61～80dB HL，81dBHL以上為極重度聽力損失。

2 結果

2.1 新生兒耳聾基因篩查結果

2.1.1 總體陽性檢出情況

表1示，75649例新生兒中耳聾基因篩查陽性者3412例，總陽性檢出率為4.51%（3412∕75649），其中GJB2基因陽性檢出率最高，為2.419%（1830∕75649），其次由高到低分別為SLC26A4基因1.520%（1150∕75649）、GJB3基 因 0.328%（248∕75649）、線粒體12SrRNA0.184%（139∕75649）及雙基因雜合突變0.059%（45∕75649）。

各基因型中，GJB2基因c.235delC單雜合突變的檢出率最高，為 1.75%（1324∕75649）；其次為SLC26A4基因c.919-2A＞G單雜合突變（1.297%,981∕75649）及GJB2基因c.299_300delAT單雜合突變（0.498%,377∕75649）。

2.1.2 等位基因檢出率

2.1.2 .1GJB2基因

表2示，本研究共檢出1878例GJB2基因陽性者，其中純合突變7例，雜合突變1871例。GJB2基因等位基因檢出率為1.25%（1885∕151298），其中c.235delC最高，為0.91%（1380∕151298），其次分別為 c.299_300delAT（0.25% ，385∕151298）、c.176_191del16（0.07%，110∕151298）及 c.35delG（0.01%，10∕151298）。

表1 3412例陽性者的基因型Table 1 The genotype of 3412 positively detected patients

2.1.2.2SLC26A4基因

表3示，本研究共檢出1186例SLC26A4基因陽性者，其中純合突變1例，雜合突變1185例。SLC26A4基因等位基因檢出率為0.78%（1887∕151298），其中c.919-2A＞G突變檢出率最高，為0.67%（1010∕151298），其次為 c.2168A＞G（0.12%，177∕151298）。

2.1.2 .3GJB3基因

本研究共檢出c.538C＞T單雜合突變248例，基因型為 c.235delC∕c.538C＞T、c.919-2A＞G∕c.538C＞T及c.2168A＞G∕c.538C＞T的雙基因雜合突變各4例、3例及1例，GJB3基因的等位基因檢出率為0.17%（253∕151298）。

2.2 確診者隨訪結果

2.2.1 一般情況

本研究中純合∕復合雜合突變共17例，成功追訪15例，失訪2例。15例成功追訪者平均月齡為72.93個月，均為GJB2雙等位基因突變，其中c.235delC純合突變7例，c.235delC∕c.299_300delAT復合雜合突變4例，c.176_191del16∕c.235delC復合雜合突變4例。隨訪情況見表4。

2.2.2 新生兒聽力篩查結果

15例成功隨訪的純合∕復合雜合突變者中，新生兒聽力篩查雙耳未通過12例，占80%；雙耳通過3例，占20%，其中c.235delC∕c.235delC1例，c.235delC∕c.176_191del16 2例，各基因型的聽力篩查情況見表5。

2.2.3 聽力損失程度

成功隨訪的15例純合∕復合雜合突變者均確診為感音神經(jīng)性聽力損失，聽力損失程度以重度及極重度為主，占 66.67%（10∕15），其次為中度20%（3∕15），輕度13.33%（2∕15），基因型及聽力損失程度見表6。

2.2.4 干預情況

成功隨訪的15例中，13例接受了聽力干預，干預率為86.67%（13∕15），其中雙側人工耳蝸1例，單側人工耳蝸2例，人工耳蝸與助聽器雙模式6例，雙側助聽器4例；2例未接受聽力干預，其中1例為唐氏綜合征，目前無法進行正常交流；1例雙耳輕度聽力損失，目前言語發(fā)育尚可，可進行一般交流。

助聽器初始干預的中位月齡為6個月（3個月～3歲），人工耳蝸干預的中位月齡為18個月（8個月～4歲），初始干預月齡分布見表7。13例接受聽力干預的患兒中，初始干預月齡主要集中在6月齡內(nèi)，占46.15%（6∕13），7～12月齡占15.39%（2∕13），13～24月齡占15.39%（2∕13），25～36月齡占15.39%（2∕13），大于36月齡占7.68%（1∕13）。

成功隨訪的15例患兒中，14例就讀于正常小學或幼兒園，正常就讀率93.33%，其中10例上正常小學，4例上正常幼兒園。

表2耳聾基因篩查陽性者GJB2基因突變位點檢出率Table 2 The detection rate of mutations in GJB2 among positively detected patients

表3耳聾基因篩查陽性者SLC26A4基因突變位點檢出率Table 3 The detection rate of mutations in GJB2 among positively detected patients

表4 17例純合/復合雜合者隨訪情況Table 4 The follow-up information of 17 cases with homozygous/compound heterozygous mutations

表5基因型及新生兒聽力篩查情況Table 5 Genotypes and UNHS

表6基因型及聽力損失程度Table 6 Genotypes and degrees of HL

表7初始干預月齡分布Table 7 Distribution of initial intervention age

3 討論

隨著新生兒聽力與耳聾基因聯(lián)合篩查的開展，越來越多的耳聾基因突變攜帶者被檢出，陽性檢出率及純合∕復合雜合突變者的臨床聽力學特點及干預情況是臨床的關注點。本研究重點分析了北京地區(qū)大樣本新生兒耳聾基因篩查的陽性檢出率、等位基因檢出率及純合∕復合雜合突變者（確診者）的新生兒聽力篩查情況、聽力損失程度、干預時間及干預效果，具體從以下四個方面進行討論。

3.1 陽性檢出率分析

本研究共檢測北京地區(qū)新生兒耳聾基因篩查75649例，攜帶者3412例，陽性檢出率4.51%。王秋菊[5]等對1,172,234例全國地區(qū)的新生兒進行研究，發(fā)現(xiàn)耳聾基因篩查陽性檢出率為4.78%（55977∕1172234）。Chen等[9]對我國18篇新生兒耳聾基因篩查的文獻進行meta分析，發(fā)現(xiàn)新生兒耳聾基因陽性檢出率為4.7%。在此之前，國內(nèi)學者報道了我國不同地區(qū)的陽性檢出率。姚聰?shù)萚10]報道武漢市陽性檢出率為 3.00%（3541∕117930）；Zhang[11]等報道了天津地區(qū)為5.52%（3225∕58397）。本研究的陽性檢出率高于姚聰?shù)葓蟮赖?.00%，低于Zhang等報道的5.52%，原因可能為篩查的基因及突變位點存在差異，姚聰?shù)鹊暮Y查方法為3個基因4個位點(GJB2：c.235delC；SLC26A4：c.919-2A ＞ G；線粒體12SrRNA:m.1555A ＞ G，m.1494C ＞ T)，Zhang等的篩查方法為4個基因20個位點(GJB2:c.35delG、c.167delT 、c.176del16、c.235delC及 c.299delAT；SLC26A4： c.281C＞T、 c.589G＞A、 c.919-2A＞G、c.1174A ＞T、c.1226G＞A、c.1229C＞T、c.IVS15+5G ＞A、c.1975G＞C、c.2027T＞A 、c.2162C＞T 及c.2168A＞G；GJB3：c.538C＞T,c.547G ＞A；線粒體12Sr RNA：m.1555A＞G,m.1494C＞T)，本研究的篩查方法為4個基因9個位點。本研究的陽性檢出率與王秋菊等報道的4.78%及Chen等報道的4.53%最為接近。綜上所述，國內(nèi)不同地區(qū)新生兒耳聾基因篩查方式存在差異，耳聾基因陽性檢出率不盡相同，是否有地區(qū)差異值得進一步探討。

本研究篩查的4個基因中，GJB2基因陽性檢出率最高，為2.419%（1830∕75649），其次由高到低分別為SLC26A4基因1.520%（1150∕75649）、GJB3基因 0.328%（248∕75649）、線粒體12Sr RNA0.184%（139∕75649）及 雙 基 因 雜 合 突 變 0.059%（45∕75649）。相麗麗等[12]2015年對3288例濟南地區(qū)的新生兒進行耳聾基因篩查，發(fā)現(xiàn)GJB2基因陽性檢出率為 2.76%（91∕3288），SLC26A4基因為 1.22%（40∕3288）,GJB3基因為 0.27%（9∕3288），線粒體12Sr RNA為0.21%（7∕3288）。國內(nèi)學者王秋菊等[6]2019年報道的1,172,234例新生兒聽力及耳聾基因聯(lián)合篩查的文章中，線粒體12Sr RNA檢出率為0.23%（2638∕1172234）。本研究的研究結果與相麗麗等及王秋菊等基本一致，提示在中國人群中，GJB2基因及SLC26A4基因突變檢出率較高，線粒體12Sr RNA基因突變在中國人群中亦較為常見，新生兒耳聾基因篩查能早期發(fā)現(xiàn)常見耳聾基因致聾突變者，早期明確耳聾患者的病因，并為耳聾風險人群提供早期用藥指導。

3.2 等位基因檢出率分析

以等位基因計算，本研究GJB2基因中c.235delC突變檢出率最高，為0.91%（1380∕151298），其次分別為 c.299_300delAT（0.25%，385∕151298）、c.176_191del16（0.07%，110∕151298）及 c.35delG（0.01%，10∕151298）。戴樸等[13]2009年對2063例中國非綜合征性耳聾患者進行GJB2基因突變頻譜研究發(fā)現(xiàn)c.235delC突變最為常見，占GJB2基因致聾突變的68.9%，其次為c.299_300delAT、c.176_191del16。紀育斌等的研究表明，我國耳聾人群中，GJB2基因最常見的致病突變位點為c.235delC，其次為c.299delAT、c.176del16和c.35delG，各等位基因檢出率分別約為11.90%、2.22%、0.65%和0.27%[14]。本研究各位點的檢出率分布與戴樸等及紀育斌等的研究一致，均為c.235delC和c.299delAT最常見。但本研究的突變檢出率低于紀育斌等的報道，原因在于，本研究的研究對象為新生兒，紀育斌等的研究對象為非綜合征性耳聾患者。

SLC26A4基因中c.919-2A＞G突變檢出率最高，為 0.67%（1010∕151298），其次為 c.2168A＞G（0.12%，177∕151298）。Mahbobeh[15]等對伊朗地區(qū)SLC26A4基因致聾情況進行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)在伊朗致聾人群中，SLC26A4基因的檢出率為6.39%，其中以c.1334T＞G位點最為常見。以往研究表明，SLC26A4基因的位點突變存在著明顯的地域和種族差異，在中國人群中最常見的突變位點為c.919-2A＞G，其次為 c.2168A＞G[16]，本研究結果與以往研究一致。

3.3 純合∕復合雜合突變者的聽力學特點

關于新生兒聽力篩查特點，15例成功隨訪的患兒均為GJB2雙等位基因突變，新生兒聽力篩查雙耳未通過12例，占80%；新生兒聽力篩查雙耳通過3例，占20%。3例雙耳通過的新生兒均被診斷為雙側聽力損失，經(jīng)過隨訪發(fā)現(xiàn)聽力表型較為穩(wěn)定，目前未出現(xiàn)聽力進展。以往研究證實，GJB2基因致聾突變患兒在出生時非外顯率為6.9%[17]。本課題組前期[18]通過對20例中國GJB2復合雜合突變嬰幼兒的聽力學特點進行分析，發(fā)現(xiàn)15%（3∕20）患兒通過了新生兒聽力篩查，之后確診為中度聽力損失。本研究新生兒聽力篩查通過率較高，原因可能為純合∕復合雜合突變患兒例數(shù)較少。以上研究提示新生兒聽力篩查能有效檢出大部分純合∕復合雜合突變者，但部分GJB2純合∕復合雜合突變者，出生時可能表現(xiàn)為遲發(fā)性聾，提示新生兒聽力聯(lián)合耳聾基因篩查具有重要意義。臨床工作中，應該重視并警惕新生兒聽力篩查通過但耳聾基因篩查異常者，早期發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性耳聾人群。

本研究成功隨訪的15例GJB2基因純合∕復合雜合突變者均為移碼突變，聽力損失程度表現(xiàn)為輕度至極重度，以重度及極重度為主（66.67%，10∕15）。本課題組前期[19]對43例GJB2基因純合或復合雜合突變的兒童研究發(fā)現(xiàn)，聽力損失程度以重度為主(60.87%,26∕43)。Ma等[20]和 Dylan 等[21]分別對112例和52例GJB2雙等位基因突變的新生兒研究發(fā)現(xiàn)，移碼突變組聽力損失程度均以重度為主。本研究的結果與前人一致，提示新生兒耳聾基因篩查確診者均有不同程度的聽力損失，尤其是GJB2基因純合∕復合雜合移碼突變者，聽力損失程度以重度為主，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預對此類患兒的言語發(fā)育至關重要。

3.4 純合∕復合雜合突變者的干預情況

美國嬰幼兒聽力聯(lián)合委員會在2007年的形勢報告[22]中指出，對于確診聽力損失的新生兒，在確診之后應盡快接受干預服務，最遲不晚于出生后六個月。我國的《新生兒聽力篩查技術規(guī)范（2010年版）》規(guī)定，對確診為永久性聽力損失的患兒應當在出生后6個月內(nèi)進行干預[23]。本研究中助聽器初始平預的中位月齡為6個月，與指南規(guī)范一致。本研究中，有46.15%接受聽力干預的純合∕復合雜合突變者在6月齡內(nèi)行初次聽力干預，明顯高于凡啟軍等[24]報道104例因雙耳聽力篩查未通過而確診的雙側重度及極重度感音神經(jīng)性耳聾患兒中，8.65%（9∕104）在6月齡內(nèi)初次行聽力干預。提示新生兒耳聾基因篩查聯(lián)合聽力篩查，可以有效提前遺傳性耳聾患兒的干預時間。

然而本研究中仍有4例重度到極重度聽力損失者，初次聽力干預年齡為2到3歲，此4例全部為復合雜合突變者，新生兒聽力篩查通過2例，提示家長對新生兒聽力篩查通過但耳聾基因篩查未通過的孩子重視程度不夠，導致家長后期對聽力干預的忽視。因此在今后的新生兒聽力及耳聾基因篩查工作中，應該進一步加強宣教工作，以提高家長的干預意識。

本研究成功追訪15例確診者中，14例就讀于正常小學或幼兒園，占93.33%，其中10例上正常小學，4例上正常幼兒園。提示通過明確遺傳性耳聾患兒的基因型和聽力表型，能實現(xiàn)遺傳性耳聾患兒的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預，助力其言語能力的發(fā)展?？偠灾z傳性耳聾患兒的早期干預效果較好，新生兒耳聾基因篩查值得推廣。

新生兒聽力與耳聾基因聯(lián)合篩查的開展能早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預遺傳性聽力損失患兒，從而減輕聽力損失對其言語功能的發(fā)育和學習生活的影響。此外，對北京地區(qū)4.51%新生兒耳聾基因陽性者進行遺傳咨詢，可明確其遺傳方式，為其提供婚育指導，能有效做到耳聾的一級預防。