袁永一 戴樸

1中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所聾病分子診斷中心(100853北京)

2國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學研究中心

3聾病教育部重點實驗室

4聾病防治北京市重點實驗室

基因檢測技術的發(fā)展推動了遺傳性耳聾分子病因的揭示，使早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)攜帶者及遺傳風險成為現(xiàn)實，基于精準診斷的預防干預有效阻斷了遺傳性耳聾在家庭內的垂直傳遞。不斷改進的分子診斷技術一方面帶來不斷提高的檢出率，另一方面也面臨著新檢測技術所帶來的數據分析的困難和變異解讀的不確定性等問題。如何合理利用新的檢測技術、提高檢測效率、降低檢測成本是臨床醫(yī)生和患者家庭共同關心的問題。本文就遺傳性耳聾診斷、篩查的適用人群、原則、策略進行初步探討，期望促進相關工作的規(guī)范化開展。

1 耳聾基因診斷方法和檢測基因范圍的選擇

用于遺傳性耳聾診斷的主要方法包括基因芯片、基因Sanger測序、目標耳聾基因靶向捕獲測序、全外顯子組測序（whole exome sequencing,WES）及全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)等。后三種以下一代測序（next-generation sequencing,NGS）技術為基礎。目前臨床上應用較多的是前三種，WES和WGS在遺傳性耳聾科研領域應用較多。近年來，目標耳聾基因靶向捕獲測序和WES逐漸成為遺傳性耳聾診斷的重要工具。這兩種檢測手段雖然有效，卻仍然存在不能檢測結構變異（structural variations,SV）的技術限制。WGS對受檢者基因組中的全部DNA序列進行檢測，較WES所覆蓋的區(qū)域更廣，不僅覆蓋了幾乎全部基因的外顯子序列，也覆蓋了內含子序列和基因間序列。現(xiàn)在認為WGS可有效避免在對相關基因組區(qū)域進行靶向富集時產生的技術偏差，不僅可以檢出單核苷酸變異（single nucleotide variations,SNV），還可以對SV進行分析，并常規(guī)性地對線粒體基因組（mitochondrial genome DNA,mtDNA）變異進行分析[1,2]。WGS應用于臨床遺傳診斷有望提高診斷率，縮短診斷流程，節(jié)省時間及降低診療費用[3]。

下一代測序有效服務耳聾基因診斷不僅依賴于檢測技術的更新，還與數據分析、變異解讀密不可分。越來越多的檢測中心開始采用美國分子病理學會（Association of Molecular Pathology,AMP）和美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（American college of medical genetics and genomics,ACMG）提出的指南，但這些指南都是自愿依從的，而且隨著正常對照及疾病變異數據庫的擴大，某些臨床意義不明的變異的致病性也在更新中。即使使用相同的解讀框架，不同實驗室的病理學家也存在分歧，甚至在某些情況下，對于同一個變異的致病性，不同機構會有不同的結論。此外，無論是WES還是WGS，其主要目的是揭示可解釋患者臨床表型的致病基因（組）變異，但在部分個體基因組中還可能檢測出與受檢指征不相關但具有重要臨床功效性（主要是指能較好預測未來發(fā)病的可能并可進行預防性干預或治療）的基因（組）變異。當這些變異是無意中被發(fā)現(xiàn)時，被稱為意外發(fā)現(xiàn)[4]。ACMG建議有意識地分析這些有重要臨床意義的基因（組）變異，并將稱其為次要發(fā)現(xiàn)[5]。意外發(fā)現(xiàn)和次要發(fā)現(xiàn)雖然一方面為檢測者提供了有用的遺傳信息，但同時也會不同程度地增加檢測者的精神壓力和心理負擔，為遺傳咨詢帶來更多挑戰(zhàn)[6,7]。

關于診斷手段的選擇，對于基因型表型對應性明確的遺傳性耳聾類型，可以有針對性地進行基因檢測，比如對顳骨CT顯示前庭水管擴大患者直接進行SLC26A4基因檢測、耳聾甲發(fā)育不全綜合征患者進行ATP6V1B2基因檢測、內耳畸形IP-Ⅲ檢測POU3F4基因。對于表型特征明確的常見綜合征型耳聾或有遺傳線索的聽神經病可以申請包含其相關基因的檢測（表1）。醫(yī)生對表型的認識決定了選擇基因檢測范圍的準確性及全面性。在檢測費用相當的情況下，選擇包含更多耳聾基因的Panel檢測性價比更高；考慮到患者的經濟條件，也可以進行階梯遺傳檢測，即常見耳聾基因測序（GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA，三者在中國感音神經性耳聾兒童群體確診率達44%）、已知耳聾基因捕獲測序Panel、WES等，一旦常見耳聾檢測診斷明確了病因則可以直接進入檢測后遺傳咨詢，但如果常見耳聾檢測陰性再進行后續(xù)檢測將延長診斷流程，提高診療費用。

耳聾基因檢測前知情同意的內容包括：（1）送檢的目的及意義；（2）檢測方法、周期及局限性；（3）預期結果及可能的風險：檢測結果可能為陽性，即在與受檢者耳聾相關的基因中找到致病性變異；陰性，即未發(fā)現(xiàn)與受檢者耳聾相關的致病性變異；或結果不確定，即在與受檢者表型相關的基因中找到意義不明的變異，或在與受檢者表型可能相關但是不確定的基因中找到致病性變異。受檢者應知悉次要發(fā)現(xiàn)的可能及其意義和風險；（4）數據及樣本處理的相關規(guī)則；（5）數據再分析的可能性。

2 新生兒耳聾基因篩查

新生兒耳聾基因篩查與聽力篩查聯(lián)合開展，可以相互補充。不僅可以發(fā)現(xiàn)先天性耳聾，還可以發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性語前聽力損失，提出預警，實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早干預；不僅能第一時間發(fā)現(xiàn)耳聾，還可明確分子病因，提高早期診斷水平[8]；新生兒耳聾基因篩查能發(fā)現(xiàn)更多的母系遺傳藥物性耳聾易感個體，通過科學的用藥指導可有效避免個體藥物性耳聾的發(fā)生；對基因篩查發(fā)現(xiàn)的隱性遺傳基因突變攜帶者，給予早期遺傳咨詢，對未來其子代發(fā)生耳聾的風險給予第一時間預警。也就是說，新生兒耳聾基因篩查同時發(fā)揮了攜帶者篩查的作用，而且把攜帶者篩查提早到剛出生。

關于新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查的處理原則見圖1。

圖1新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查的處理原則Fig.1 Management priciple of concurrent hearing and genetic screening in newborns

表1常見耳聾綜合征及遺傳性聽神經病基因列表Table 1 Gene list of common syndromic hearing loss and hereditary auditory neuropathy

3 攜帶者篩查

攜帶者篩查（carrier screening)是用來檢測每對夫妻遺傳風險的基因檢測。在懷孕前或孕期，了解夫婦雙方攜帶致病變異的風險，能夠給夫妻提供合理的生育指導，是基因組技術應用于有效預防或管理出生缺陷和罕見遺傳疾病的重要措施。最初，攜帶者檢測針對一些嚴重隱性遺傳疾病在一些有較高攜帶率的種族或人群∕地區(qū)開展。最早的在孕期女性中開展得耳聾攜帶者篩查文章發(fā)表于2013年[9]，篩查針對已知耳聾基因致病變異。孕婦耳聾基因篩查屬于遺傳性耳聾二級預防范疇，將遺傳性耳聾的診斷從新生兒提早到胎兒期，在預防耳聾出生缺陷方面發(fā)揮了重要作用。目前存在問題如下：篩查時間過晚，孕婦拿到結果時在孕中期或更晚，攜帶者孕婦配偶的基因檢測完成后，一旦確認胎兒耳聾高風險，因孕周較晚，家庭選擇引產雖避免了耳聾患兒出生，但給孕婦帶來嚴重身心損傷；部分婦產機構雖開展耳聾攜帶者篩查，但對篩查意義認識不足、結果解讀不深入，由此導致陽性孕婦轉診及配偶的進一步檢測延誤；還未在全國范圍普遍開展。

從耳聾一級預防的理念出發(fā)，孕前是為攜帶者篩查的最佳時間節(jié)點。備孕期間可以一方先篩查，如果結果陽性，配偶則要進一步檢查。配偶的檢查應針對攜帶致病變異的一方的基因進行全面測序，一旦發(fā)現(xiàn)致病變異攜帶，則確定為生育耳聾高風險家庭。對于孕前篩查發(fā)現(xiàn)耳聾高風險家庭，可以采用胚胎植入前診斷或產前診斷避免耳聾患兒出生。

關于攜帶者篩查的基因及變異數目是值得討論的問題。完整的人類基因組參考序列的完成，隨后DNA測序和基因芯片技術的速度和成本的顯著提高，使得在當前進行產前∕孕前遺傳病篩查和臨床遺傳病診斷獲得了前所未有的技術優(yōu)勢與質量保證。但是，高通量篩查帶來的潛在危險也應加以考慮和解決。關于輕度表型，不同表現(xiàn)度，低外顯率和成年期才發(fā)病的信息應該完整、透明地傳遞給受試者，允許受試者不勾選這些檢測選項。在得到陰性檢測結果之后，還必須讓受試者了解殘余風險的概念。商業(yè)化檢測實驗室有義務參與并促進這種信息傳遞。具體到耳聾，GJB2c.109G＞A突變作為篩查位點時應向篩查對象將其可能引起的表型變異特征清楚說明，并對該突變即便篩查陽性也不建議產前診斷的信息向篩查對象傳遞。

顯然擴大篩查的基因及變異位點，能提高檢出率，但納入更多位點也可能會出現(xiàn)一些變異臨床意義解釋不清的情況，使得遺傳咨詢師和患者∕攜帶者都處于兩難的境地。此外，擴大篩查范圍也會增加檢測成本（包括試劑、人力分析等方面）。我們認為，對一些極其罕見的耳聾基因變異進行篩查不符合衛(wèi)生經濟學。當發(fā)現(xiàn)罕見常染色體隱性遺傳病攜帶者，配偶同時攜帶相同基因的致病突變的機會較低，生育患病后代的風險很低，而且一旦診斷攜帶者可能會使患者誤認為自己不健康，增加不必要的精神負擔，遺傳咨詢師要花費比較多的時間精力去解釋、增加工作量。因此，對于篩查耳聾基因變異范圍來說，并非越多越好，以既能夠篩查出耳聾風險、降低子代患病率、達到優(yōu)生優(yōu)育的目的，又能符合經濟效益原則，且不給醫(yī)患雙方帶來更多的工作和精神壓力為準。

結合ACMG對攜帶者篩查的立場[10]，我們對耳聾攜帶者篩查選取的基因變異位點建議如下：

1.耳聾攜帶者篩查結果中確定的多數風險較高的受檢者及其伴侶將考慮進行產前診斷，有助于生殖的決策。對于那些以可變表現(xiàn)度或不完全外顯率為特征的疾病、已知與輕度表型相關的疾病應該是可選的（不強制），并且在使用這些技術進行篩查時應該是透明的。這項建議是以無害的道德原則為指導的；

2.當導致成年后發(fā)生的耳聾的基因（可能會影響受試者子女成年后的患病風險）包括在篩查疾病列表中時，必須向受試者說明并獲得同意篩查這些疾病，尤其是在受試者或其他家庭成員可能已經有相關癥狀提示的時候。這項建議遵循自主和無害的道德原則；

3.對于篩查的每個致病基因變異的頻率應該在被檢測的人群中是已知的，從而可以評估檢測陰性的個體中有意義的殘留風險；

4.所檢測的變異與耳聾嚴重程度之間必須有確認的臨床關聯(lián)。

4 檢測后遺傳咨詢

無論是耳聾基因篩查還是診斷，檢測后均應給予受檢方相應的檢測后遺傳咨詢，就檢測的意義及結果進行解釋和教育，輔導其進行知情選擇，使其對所患疾病及其再發(fā)風險有所認知和接受，并提供有關的治療、求助渠道、預防子代耳聾風險的方案等信息。

檢測后咨詢內容可以以全基因組測序在遺傳病檢測中的臨床應用專家共識中的建議為框架[6]，具體包括是否可就檢測結果做出明確的基因診斷或明確受檢者是否為耳聾基因突變攜帶者；是否需要針對性的輔助檢查來進一步明確檢出變異的致病相關性，尤其是對意義不明的變異；是否需要進一步對受檢者或家庭成員進行檢測驗證或排除診斷；根據基因檢測結果，是否需進行適當的治療干預，明確藥物禁忌等；根據做出的基因診斷對患者的病情預后發(fā)展等進行評估，制定治療及隨訪觀察計劃；對患者和家屬提供心理干預或社會救助資源和渠道等；根據遺傳規(guī)律對父母的再生育風險的評估及其再生育指導，包括產前診斷或胚胎植入前診斷等；患者或先證者的下一代風險評估及其再生育指導；家族內其他家庭成員的風險評估；疾病的有關研究進展信息等。需注意的是，如受檢方要求進行產前診斷或輔助生殖等，則需根據相關共識或指南明確告知風險，進行相應的指導或咨詢。

針對第三方檢測機構的報告進行遺傳咨詢時，醫(yī)生應先針對檢測質量、報告中變異評估證據、可疑變異一代測序驗證結果、變異在家系中是否與耳聾表型共分離等做出綜合評估，如果檢測結果可靠，再向患者進行結合其表型與檢測結果的遺傳咨詢。如果遇到檢測報告信息提供不全或結果有爭議的情況，要申請第三方檢測機構提供更全面的信息、甚至修正結果后再進行遺傳咨詢。

5 展望

耳聾是常見的出生缺陷，超過60%的語前聾是由遺傳因素導致的，明確遺傳致病因素是耳聾精準診治干預的前提和基礎。隨著新一代測序技術的發(fā)展，耳聾基因檢測實現(xiàn)了高通量、低成本，為其普及推廣創(chuàng)造了條件。目前，我國耳聾基因診斷、產前診斷工作穩(wěn)步開展，實施中仍面臨諸多問題，如檢測機構檢測質量水平參差不齊，缺乏標準；檢測報告尚未形成規(guī)范，變異解讀不夠明確；檢測機構和∕或臨床醫(yī)生對報告解讀不深入，無法提供準確的遺傳咨詢服務；缺乏疑難病例轉診、會診體系及流程；缺乏耳聾疾病生物數據錄入、存儲、整合、共享機制等。上述不足極大地影響了耳聾分子大數據總結、耳聾家庭再生育指導及患者的精準治療評估，給耳聾患者及家庭帶來了不必要的損失。因此，有必要開展全國范圍內的臨床多中心研究，規(guī)范工作流程、優(yōu)化檢測手段、構建耳聾基因數據庫，提升耳聾基因篩查與診斷的整體水平，真正做到為耳聾患者精準服務。