林穎 周楓 黃利芬 張群慧 王興君 王淑杰 于鋒

廣州市第十二人民醫(yī)院（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)院）（廣州510620）

近10年來(lái)，隨著遺傳性耳聾基因診斷技術(shù)的快速發(fā)展及廣泛推廣，遺傳性耳聾已被大量研究，其中非綜合征型耳聾（nonsyndromic hearing impairment，NSHI）仍占絕大多數(shù)，雖然不同國(guó)家、地區(qū)、民族、年齡的致聾基因變異有差異性，但流行病學(xué)大數(shù)據(jù)顯示我國(guó)非綜合征型耳聾的最常見(jiàn)致聾基因?yàn)镚JB2、SLC26A4、線粒體基因。因此致聾熱點(diǎn)變異篩查對(duì)了解人群中攜帶率、指導(dǎo)高危人群優(yōu)生優(yōu)育、新生兒聽(tīng)力、用藥規(guī)范等極為重要；而通量高、花費(fèi)少、接受度廣的技術(shù)則是快速精準(zhǔn)診斷的關(guān)鍵所在。本研究旨在通過(guò)十五項(xiàng)耳聾基因芯片[1]聯(lián)合Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)廣州市兩個(gè)特殊聽(tīng)障機(jī)構(gòu)的非綜合征型耳聾家庭易感基因進(jìn)行檢測(cè)，了解此機(jī)構(gòu)致聾變異的攜帶率，提高診斷率，并對(duì)高危家庭進(jìn)行遺傳咨詢及再生育指導(dǎo)[2]，以期降低聾兒的出生率。

1 資料與方法

1.1 受檢對(duì)象

遵循自愿原則，收取來(lái)自廣州市某兩個(gè)特殊聽(tīng)障機(jī)構(gòu)的先證聾兒及其父母、直系兄弟姐妹的靜脈血2-3ml血樣，80組家庭，共241人，排除嚴(yán)重的全身各系統(tǒng)器質(zhì)性病變，詳細(xì)病史采集，填寫(xiě)受檢者基本信息、耳聾家族史、噪音接觸史及以往用藥史。并按照我院倫理委員會(huì)規(guī)定簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA：采用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的《血液基因組DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）》（貨號(hào)：DT319-02），從耳聾患者外周血中提取基因組DNA，用德國(guó)Thermo公司紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃 度（100-200ng∕μl）和 純 度（OD260∕280=1.7-2.0），其余保存于-70℃冰箱備用。

1.2.2 耳聾基因芯片篩查：采用十五項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒（微陣列芯片法）（北京博奧生物有限公司，貨號(hào)300068）對(duì)DNA進(jìn)行GJB2(c.35delG，c.176del16bp，c.235delC及c.299_300delAT)，GJB3(c.538C＞T)，SLC26A4(c.919-2A＞G，c.2168A＞Gc.122 9C＞T，c.1975G＞C，c.1174A＞T，c.1226G＞A，c.2027T＞A和c.IVS15+5G＞A)和 MT-RNR1(m.1555A＞G，m.1494C＞T)15個(gè)熱點(diǎn)變異檢測(cè)。通過(guò)PCR、磁珠、雜交、芯片洗滌、芯片掃描等步驟，最后分析系統(tǒng)自動(dòng)判讀結(jié)果。

1.2.3 Sanger測(cè)序：對(duì)基因芯片檢測(cè)出純合變異、復(fù)合雜合變異和單雜合變異的家庭進(jìn)行編碼序列分析驗(yàn)證。此步驟由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.4 序列對(duì)比：DNA測(cè)序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站（http:∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）公布的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1耳聾基因芯片檢測(cè)結(jié)果：在80組先證者家庭中，25組家庭成員攜帶耳聾相關(guān)突變，16組家庭為GJB2基因（占先證者的20%），9組家庭為SLC26A4基因（占先證者的11.25%），家庭的總檢出率為31.25%（25∕80）。所有241人中，GJB2及SLC26A4基因共 62例，總檢出率為 25.73%（62∕241），以GJB2c.235delC（34∕62）與SLC26A4c.919-2A＞G（16∕62）熱點(diǎn)變異居多。GJB2基因中，c.235delC純合變異占總?cè)藬?shù)的2.49%（6∕241），雜合變異占總?cè)藬?shù)的11.62%（28∕241），c.299_300delAT雜合變異占總?cè)藬?shù)的1.24%（3∕241），檢測(cè)出c.176del16bp雜合變異、c.235delC∕c.299_300delAT復(fù)合、c.176del16bp∕c.299_300delAT復(fù)合雜合變異各1例；SLC26A4基因中，c.919-2A＞G純合變異占總?cè)藬?shù)的0.83%（2∕241），雜 合 變 異 占 總 人 數(shù) 的 5.81%（14∕241），c.2168A＞G純合變異占總?cè)藬?shù)的0.41%（1∕241），雜合 變 異 占 總 人 數(shù) 的 1.24%（3∕241），檢 測(cè) 出c.919-2A＞G∕c.1229C＞T復(fù)合雜合變異1例；野生型合計(jì)179人，未檢測(cè)出MT-RNR1及GJB3基因。具體結(jié)果如下表（表1）。

2.2基因測(cè)序結(jié)果

對(duì)攜帶基因芯片陽(yáng)性的25組家庭（包括野生型成員）共79人進(jìn)行Sanger測(cè)序。62例基因芯片陽(yáng)性結(jié)果通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，符合率達(dá)100%；除基因芯片包含的位點(diǎn)外，還檢測(cè)出部分多態(tài)性、點(diǎn)突變等，共計(jì)陽(yáng)性結(jié)果為73例，總檢出率為30.30%（73∕241），其中GJB249例，SLC26A424例；在進(jìn)行GJB2基因測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)c.109G＞A、c.79G＞A、c.341A＞G變異；在進(jìn)行SLC26A4基因測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)c.259G＞T、c.754T＞C變異。具體結(jié)果如下表（表2）。

表1 15項(xiàng)基因芯片陽(yáng)性結(jié)果Table 1 The positive result of 15 targeted DNAmicroarray

表2 Sanger測(cè)序結(jié)果與基因芯片對(duì)比分析結(jié)果Table 2 The comparison of Sanger Sequencing with DNAmicroarray

2.3GJB2c.109G＞A基因型、聽(tīng)力表型等情況

本次共檢測(cè)出10例攜帶c.109G＞A變異，其中1例純合變異，3例c.109G＞A單雜合變異，6例復(fù)合雜合變異，具體情況如下表（表3）。

3 討論

眾所周知，基因變異具有普遍性、隨機(jī)性、低頻性、不定向性、多害少利性等特點(diǎn)，查閱文獻(xiàn)及全國(guó)大樣本數(shù)據(jù)顯示我國(guó)最多見(jiàn)的遺傳性耳聾相關(guān)變異基因?yàn)镚JB2、SLC26A4、MT-RNR1，占耳聾相關(guān)基因的30-40%，成為遺傳性耳聾的常見(jiàn)病因。本課題組前期研究中，取珠三角地區(qū)數(shù)個(gè)聽(tīng)障機(jī)構(gòu)聾兒的樣本行9項(xiàng)耳聾基因篩查，發(fā)現(xiàn)GJB2與SLC26A4基因攜帶率極為接近[3]，雖9項(xiàng)耳聾基因芯片覆蓋了約80%的熱點(diǎn)致聾基因及位點(diǎn)，但仍可能出現(xiàn)漏診現(xiàn)象，因此，近期我們利用15項(xiàng)耳聾基因芯片技術(shù)聯(lián)合一代測(cè)序技術(shù)對(duì)廣州市某2個(gè)聽(tīng)障機(jī)構(gòu)的家庭進(jìn)行檢測(cè)，旨在提高檢測(cè)率，了解該家庭的可能分子構(gòu)成，同時(shí)為患病家庭提供遺傳咨詢及生育指導(dǎo)。

通過(guò)本次芯片篩查，此機(jī)構(gòu)最常見(jiàn)的致聾變異為GJB2，其次是SLC26A4，本次未檢測(cè)出MT-RNR1及GJB3。其中GJB2c.235delC（占總?cè)藬?shù)的14.11%），SLC26A4c.919-2A＞G（占總?cè)藬?shù)的6.64%）熱點(diǎn)變異居多，與國(guó)內(nèi)主流報(bào)道相似。由于GJB2突變存在明顯的種族差異性，約49%的白種人家族常染色體隱性的耳聾是由GJB2導(dǎo)致的[4,5]；高加索人熱點(diǎn)突變?yōu)?5delG，突變攜帶率為1.3%-2.8%[6]；猶太人熱點(diǎn)突變?yōu)?67delT，在非綜合征型耳聾中的突變率占據(jù)53%[7]。通過(guò)金標(biāo)準(zhǔn)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證，除芯片包含的最常見(jiàn)位點(diǎn)外，還檢測(cè)出了c.109G＞A變異。目前，對(duì)c.109G＞A的研究存在爭(zhēng)議，大部分研究者趨向?qū).109G＞A錯(cuò)義突變歸于致病變異。他們認(rèn)為c．109G＞A純合突變的耳聾患者，表達(dá)產(chǎn)物縫隙連接蛋白的粘連受到影響，無(wú)法形成縫隙連接通道而導(dǎo)致耳聾[8]。攜帶c.109G＞A變異的聽(tīng)力表型有異質(zhì)性，本次共檢測(cè)出10例攜帶c.109G＞A變異，其中1例純合變異為一位聾兒家長(zhǎng)，雙耳聽(tīng)力正常，中耳未見(jiàn)明顯病變，無(wú)家族遺傳史。另外3例攜帶c.109G＞A單雜合變異的聾兒家長(zhǎng)，亦無(wú)聽(tīng)力下降；僅有1例c.109G＞A、c.235delC、c.341A＞G復(fù)合與1例c.109G＞A∕c.235delC先證者為雙耳重度聾患者。國(guó)內(nèi)統(tǒng)計(jì)正常人群中攜帶c.109G＞A的比例為12.5%，本次檢測(cè)有10例，說(shuō)明攜帶的比率較大，對(duì)耳聾基因的篩查有一定的參考意義，可能存在某些修飾基因[9]或其他調(diào)控區(qū)變異共同作用導(dǎo)致表型的異質(zhì)性。另外，一般認(rèn)為雙等位基因突變可以導(dǎo)致表型的出現(xiàn)，對(duì)于大多數(shù)GJB2c.235delC純合突變的患者表現(xiàn)為語(yǔ)前重度-極重度聾，僅極少表現(xiàn)為語(yǔ)后中度聾，但在一個(gè)Trios家系中，聽(tīng)力正常、c.235delC單雜合的父母育有一對(duì)子女均為c.235delC純合突變（芯片+Sanger測(cè)序），先證者7歲的妹妹卻雙耳聽(tīng)力均正常，實(shí)屬罕見(jiàn)。國(guó)內(nèi)解放軍總院有報(bào)道[10]1例38歲左耳突聾的c.235delC純合突變患者聽(tīng)力表型為遲發(fā)型中度聾，并分析表型差異的可能機(jī)制為Connexin30過(guò)表達(dá)的補(bǔ)償作用及修飾基因作用。因此，為探索其機(jī)制，本病例仍需繼續(xù)進(jìn)一步研究。

表3 10例c.109G＞A變異患者的一般情況Table 3 The relevant information of 10 variations with c.109G＞A

SLC26A4基因由于有21個(gè)外顯子，變異存在廣泛的等位基因異質(zhì)性，中國(guó)人最常見(jiàn)的c.919-2A＞G及c.2168A＞G突變位點(diǎn)主要集中在7、8、19外顯子上，白人中c.1246A＞C、p.L236P和lVS8+1G＞A是Pendred綜合征患者最常見(jiàn)的幾種突變類型[11]，日本c.2168A＞G[12]和蒙古p.L676Q[13]是突變頻率較高的類型。本次c.919-2A＞G的檢出率在SLC26A4基因中最高，成為選取的聽(tīng)障機(jī)構(gòu)中第二主要病因，再次驗(yàn)證與我國(guó)的SLC26A4基因突變頻譜[14]一致。十五項(xiàng)耳聾基因芯片較原來(lái)的9個(gè)位點(diǎn)篩選項(xiàng)目多出了6個(gè)SLC26A4高頻位點(diǎn)，因此相對(duì)以往該基因的檢出率提高，本次檢測(cè)出有c.1229C＞T變異，Sanger測(cè)序結(jié)果還發(fā)現(xiàn)c.259G＞T、c.754T＞C的已知致病突變。本研究中基因芯片篩查的SLC26A4單雜合先證者經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3例攜帶雙等位基因致聾，CT驗(yàn)證為雙側(cè)前庭水管擴(kuò)大伴Mondini畸形；仍有先證者為單雜合致聾，對(duì)于這部分單雜合突變引起表型的改變，可能在啟動(dòng)子區(qū)或隱藏的剪接位點(diǎn)上存在某一些未被檢測(cè)到的突變位點(diǎn)；或者其他未知基因共同發(fā)揮作用；或者與單核苷酸多態(tài)性、拷貝數(shù)變異有關(guān)；還有可能由于環(huán)境因素的影響[15]。因此需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

雖然本次未檢測(cè)出MT-RNR1及GJB3基因，僅能說(shuō)明本研究選取的聽(tīng)障機(jī)構(gòu)內(nèi)暫無(wú)MT-RNR1及GJB3基因的常見(jiàn)變異，間接證明MT-RNR1及GJB3基因致聾的發(fā)生率遠(yuǎn)低于GJB2與SLC26A4基因，并且隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及對(duì)醫(yī)學(xué)常識(shí)的普及，在廣州這個(gè)經(jīng)濟(jì)相對(duì)發(fā)達(dá)的城市，氨基糖甙類藥物的使用明顯減少，因此發(fā)生藥物性耳聾的幾率也相對(duì)下降；而GJB3基因變異的致病性向來(lái)存在質(zhì)疑，有新研究報(bào)道，c.538C＞T不一定和非綜合征型遺傳性耳聾相關(guān)[16]。從本次結(jié)果看，Sanger測(cè)序提高了致聾基因的檢出率，芯片篩查結(jié)合金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)我們?yōu)椴糠旨彝ッ鞔_了病因，同時(shí)按照孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，為有再生育的家庭提供了遺傳咨詢。對(duì)于明確先證者為GJB2與SLC26A4基因致聾病因的家庭，有再生育計(jì)劃時(shí)，可實(shí)施產(chǎn)前診斷、胚胎植入前基因診斷（PGD）或無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）[17]；而此類先證者，在選擇結(jié)婚對(duì)象時(shí)，雙方均應(yīng)該進(jìn)行耳聾相關(guān)基因檢測(cè)，建議盡量避免同基因型雙方進(jìn)行婚配；并且在孕前、育前、懷孕期間、分娩后的新生兒，均應(yīng)進(jìn)行準(zhǔn)確的遺傳咨詢，避免生育患者同樣表型的患者。

本研究通過(guò)十五項(xiàng)耳聾基因芯片聯(lián)合一代測(cè)序技術(shù)對(duì)廣州市兩所聽(tīng)障機(jī)構(gòu)的Trios家系進(jìn)行常見(jiàn)遺傳性耳聾熱點(diǎn)致病基因篩查并驗(yàn)證，結(jié)果提示廣州市此特殊聽(tīng)障機(jī)構(gòu)的耳聾相關(guān)基因熱點(diǎn)變異仍以GJB2c.235delC與SLC26A4c.919-2A＞G最常見(jiàn)，其他非熱點(diǎn)變異也占一定比例。在大規(guī)模高危人群篩查、新生兒及孕婦篩查中，使用十五項(xiàng)耳聾基因芯片能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出熱點(diǎn)變異；由于基因芯片的檢測(cè)位點(diǎn)有限，可聯(lián)合一代測(cè)序提高非綜合征型耳聾的變異檢出率并驗(yàn)證準(zhǔn)確性；對(duì)常見(jiàn)耳聾基因檢測(cè)陰性的個(gè)體，可采取目標(biāo)基因外顯子捕獲及測(cè)序（NGS panel）進(jìn)一步幫助患者明確病因[18]；有條件的家庭或?qū)嶒?yàn)室還可對(duì)NGS panel陰性的個(gè)體進(jìn)行全外顯子或全基因組，并進(jìn)行拷貝數(shù)變異（CNV）檢測(cè)分析。總而言之，在這個(gè)信息高速發(fā)展的時(shí)代，檢測(cè)技術(shù)的成本下降，醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)聯(lián)合多種技術(shù)，中和利弊，為患者提供準(zhǔn)確可靠的耳聾基因診斷、開(kāi)展專業(yè)的遺傳咨詢、婚育指導(dǎo)、耳聾風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、干預(yù)出生缺陷。