陳 榮，張喜懿，田 浪，溫貴蘭*，祝 景，晏旭紅，付尚林

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550016)

鋅指蛋白是1類重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核轉(zhuǎn)錄基因組中，在生命過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，如細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等，主要與RNA和DNA相互作用[1]。Berg[2]等依據(jù)鋅指蛋白在功能和序列上的不同將其分為9類，CCCH型(C和H分別代表半胱氨酸和組氨酸)是其中1類，而CCCH型中研究最多的是Tristetraproin(TTP)。TTP開(kāi)放閱讀框?yàn)?81 bp，共編碼326個(gè)氨基酸，最早發(fā)現(xiàn)于纖維原細(xì)胞中，是對(duì)血清和胰島素響應(yīng)的早期基因蛋白產(chǎn)物，通常存在于核靜止細(xì)胞，蛋白表達(dá)水平較低，但在血管生成過(guò)程中的極早期表達(dá)水平比較高，促進(jìn)血管的生成[3]。TTP是1種ARE(AU-rich element)結(jié)合蛋白，功能明確，可與一些炎性因子mRNA上的ARE結(jié)合，降低mRNA的半衰期，在炎癥和病毒感染中有重要的負(fù)調(diào)控作用[4]。近年來(lái)的研究表明，TTP可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，具有抑癌基因功能，對(duì)腦水腫起保護(hù)作用，TTP可作為HIV-1(Human immunodeficienvy virus 1)復(fù)制和AHRR(Aryl hydrocarbon receptor repressor)的調(diào)控因子；TTP水平降低在糖尿病性腎病中可作為早期腎損害標(biāo)記之一等[5～9]。蘇太豬是我國(guó)培育的國(guó)家級(jí)瘦肉型新品種，具有性成熟早、性情溫順、耐粗飼、肉味香等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)關(guān)于蘇太豬肉質(zhì)和繁殖能力研究的內(nèi)容較多，而對(duì)其基因研究較少[10]。本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出蘇太豬源TTP基因CDS區(qū)，并進(jìn)行克隆及序列測(cè)定、遺傳進(jìn)化分析，以期為深入研究蘇太豬源TTP基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD-19T載體、2×ESTaqMaster Mix、連接酶SolutionⅠ，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；蘇太仔豬血，采自貴州省黔東南州某養(yǎng)殖公司。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)及合成：根據(jù)GenBank公布的野豬源TTP基因 (登錄號(hào)：HM480487.1)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物。引物序列為：TTP-EcoRV-5’flag-F：CGGATATCTATGGATCT CACCGCCATCTACG;TTP-NotI-5’flag-R：GCGCG GCCGCTTACTCAGAAACAGAAATACG。下劃線部分為酶切位點(diǎn)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2蘇太豬血液總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取蘇太豬血液總RNA；根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.3PCR擴(kuò)增：以所得cDNA為模板進(jìn)行TTP基因PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物(3.3 nmol/L)各1 μL，cDNA 2 μL，2×ESTaqMaster Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 4 min，95 ℃變性40 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，預(yù)擴(kuò)增片段大小981 bp。

1.2.4克隆與測(cè)序：將PCR產(chǎn)物根據(jù)膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體連接。連接體系12 μL：連接酶Solution Ⅰ 6 μL，純化的PCR產(chǎn)物5 μL，pMD-19T載體1 μL。連接條件：16 ℃過(guò)夜。將全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并加入LB液體培養(yǎng)基750 μL，于37 ℃ 150 r/min搖床中培養(yǎng)1.5 h，取出至4 ℃離心機(jī)上以5 000 r/min離心5 min，棄去上清，留菌液200 μL，將菌液與沉淀混合后均勻涂布于含氨芐的 LB 固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，以單個(gè)菌落純培養(yǎng)后的菌液為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)并提取菌液質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。雙酶切體系 20 μL：NotI 1 μL，EcoRV 1 μL，BSA 2 μL，10xH 2 μL，重組質(zhì)粒cDNA 10 μL，ddH2O 4 μL。雙酶切條件：37 ℃ 4～8 h。經(jīng)菌液PCR和雙酶切技術(shù)鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.5遺傳進(jìn)化分析：采用NCBI網(wǎng)站的 BLAST與DNAStar軟件包中的MegAlign比對(duì)測(cè)序所得TTP基因與GenBank中公布的野豬、羊駝、單峰駱駝等不同種源TTP基因的核苷酸序列和氨基酸序列，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。參考序列見(jiàn)表1。

表1 參考序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)反轉(zhuǎn)錄合成的蘇太豬血液cDNA進(jìn)行TTP基因PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在約981 bp處出現(xiàn)特異性條帶(見(jiàn)圖1)，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符合。

圖1 蘇太豬源TTP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M：2 000 DNA Marker；1～3：TTP擴(kuò)增片段；4：陰性對(duì)照

2.2 克隆結(jié)果將PCR產(chǎn)物膠回收后，與pMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以單個(gè)菌落純化后的菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果分別見(jiàn)圖2、圖3。由圖2可見(jiàn)，菌液PCR獲得大小約981 bp的特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增條帶大小相符。由圖3可見(jiàn)，重組質(zhì)粒酶切獲得約2 692 bp的載體條帶和981 bp的目的條帶，可初步判斷目的基因成功克隆至pMD-19T載體。

圖2 蘇太豬源TTP基因菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果M：2 000 DNA Marker；1：陰性菌液；2、3：陽(yáng)性菌

圖3 蘇太豬源TTP基因雙酶切鑒定結(jié)果M：2 000 DNA Marker；1、2：重組質(zhì)粒

2.3TTP基因測(cè)序結(jié)果將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，結(jié)果可見(jiàn)：蘇太豬源TTP基因CDS區(qū)長(zhǎng)為981 bp，其堿基組成見(jiàn)表2，其中C堿基的含量最高為40.37%，A堿基的含量最低為15.49%。

表2 TTP基因核苷酸序列分析

2.4 遺傳進(jìn)化分析

2.4.1蘇太豬源TTP基因的同源性分析：將克隆后的蘇太豬源TTP基因核苷酸序列與GenBank中預(yù)測(cè)公布的13株不同種源的TTP基因利用DNAStar軟件包中MegAlign進(jìn)行同源性比對(duì)。由圖4可見(jiàn)，蘇太豬源TTP基因核苷酸序列與野豬源TTP基因的同源性最高(99.8%)，僅有0.2%的變異度；其次是與羊駝TTP基因的核苷酸序列具有較高的一致性(92.8%)；與非洲巨頰囊鼠的核苷酸同源性最低(84.8%)。由圖5可見(jiàn)，蘇太豬源TTP基因氨基酸序列與參考序列野豬源氨基酸同源性完全一致，與小家鼠的氨基酸同源性最低(88.7%)。

圖4 不同種源TTP基因核苷酸序列的同源性比對(duì)

圖5 不同種源TTP基因氨基酸序列的同源性比對(duì)

2.4.2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析：利用DNAStar程序包中MegAlign軟件構(gòu)建不同種源TTP基因核苷酸序列和氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖6、圖7可見(jiàn)，蘇太豬源TTP基因與參考序列野豬源(HM480487.1)TTP基因在遺傳進(jìn)化樹(shù)上處于同一小分支，親緣關(guān)系最近；與牛、綿羊的親緣關(guān)系次之；與白鱀豚、虎鯨的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖6 蘇太豬源TTP基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

圖7 蘇太豬源TTP基因氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究表明，蘇太豬源TTP基因CDS全長(zhǎng)981 bp，共編碼 326個(gè)氨基酸，C堿基含量最高(40.37%)，A堿基含量最低(15.49%)。同源性比較發(fā)現(xiàn)，蘇太豬源TTP基因核苷酸序列和氨基酸序列與野豬源(HM480487.1)TTP基因具有非常高的一致性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，本次擴(kuò)增的蘇太豬源TTP基因與野豬源(HM480487.1)TTP基因在遺傳進(jìn)化樹(shù)上處于同一小分支，親緣關(guān)系最近，與白鱀豚、虎鯨的親緣化關(guān)系最遠(yuǎn)。同源性分析結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致，表明TTP基因在同種屬之間具有高度保守性。本試驗(yàn)首次對(duì)蘇太豬源TTP基因的CDS區(qū)進(jìn)行了克隆，并對(duì)該基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，為進(jìn)一步了解蘇太豬源TTP基因的生物學(xué)特性和功能奠定了理論基礎(chǔ)。