朱銘瑋 鄒雨婷 李永榮 李淑嫻

( 1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 南京綠宙薄殼山核桃科技有限公司，江蘇 南京 210014)

牡丹（Paeonia suffruticosa）是毛茛科（Ranunculaceae）、芍藥屬（Paeonia）多年生落葉灌木，在我國分布范圍較廣。油用牡丹是牡丹組中結(jié)實力強，能夠生產(chǎn)種子及加工食用牡丹籽油的一個特殊類型。2011年3月以牡丹籽仁為原料提煉出的牡丹籽油被衛(wèi)生部批準為新資源食品[1]。對牡丹籽油的成分進行分析后，人們發(fā)現(xiàn)其主要以亞麻酸、油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸為主的37種成分組成，其中不飽和脂肪酸占總量83.42%[2]，特別籽油中α-亞麻酸含量較高，是橄欖油的140倍[3]，因此牡丹籽是一種適宜開發(fā)利用的良好油料資源，具有廣闊的發(fā)展前景。

生產(chǎn)上油用牡丹多用種子進行繁殖，但是該種子存在休眠習(xí)性，需要經(jīng)過6個月以上的層積才能正常萌發(fā)，這給播種繁殖帶來了很多不便。以往的研究表明，造成鳳丹（P. ostill‘Fengdan'）種子休眠的原因是種胚形態(tài)發(fā)育不完全以及種子內(nèi)存在抑制物引起的生理休眠，是綜合休眠[4]。宋會興等[5]認為四川牡丹種子（P. decomposita）的種皮、胚乳中含有抑制白菜種子萌發(fā)及幼苗生長的物質(zhì)，并且隨著該物質(zhì)濃度的增加，抑制作用更為顯著，但是對造成其休眠的抑制物的種類卻未開展研究。本研究以油用牡丹的主栽品種群——鳳丹種子為材料，從內(nèi)源抑制物質(zhì)角度討論其休眠原因，通過系統(tǒng)溶劑分離法對鳳丹種皮和種胚的浸提液進行分離，并對各提取相進行生物測定，結(jié)合氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)分析造成鳳丹種子休眠的內(nèi)源抑制物的成分，探討內(nèi)源抑制物與種子休眠的關(guān)系，以期為種子生物學(xué)及休眠機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

油用牡丹‘鳳丹'種子，從安徽亳州采后置于5 ℃冰箱儲藏；市售白菜種子（矮腳黃），純度≥95.0%，發(fā)芽率≥85%。

1.2 實驗方法

1.2.1 鳳丹種子內(nèi)源抑制物的提取

稱取飽滿鳳丹種子50 g，將其分為種皮、種胚2個部分，用粉碎機磨碎后，置于500 mL錐形瓶中，再加入400 mL的80%甲醇溶液，于4 ℃條件下密閉浸提，其間多次取出攪拌，使浸提充分。24 h后過濾浸提液，再向錐形瓶中加入400 mL的甲醇溶液，連續(xù)浸提3次，最后將3次浸提液合并。在60 ℃下減壓蒸除甲醇和部分水，最后將濃縮液定容至200 mL。

1.2.2 鳳丹種子內(nèi)源抑制物的初步分離

采用系統(tǒng)溶劑分離法[6]對上述種子各部位的甲醇提取液進行初步分離，將得到的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相浸提液，分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行濃縮蒸發(fā)，然后定容為200 mL，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.3 鳳丹種子分離相的生物活性測定

以白菜種籽為材料，對上述各相提取的溶液進行生物測定，具體為：取各相浸提液5 mL，分別加入鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，待有機溶劑揮發(fā)后，加5 mL蒸餾水，對照加入相同體積的蒸餾水。隨機數(shù)取白菜籽50粒，3次重復(fù)，置于培養(yǎng)皿中，隨后將培養(yǎng)皿放在25 ℃的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行發(fā)芽實驗，當(dāng)胚根伸長至1 cm時即認為該粒種子已經(jīng)發(fā)芽，每8 h統(tǒng)計1次，連續(xù)3 d種子發(fā)芽粒數(shù)不超過1%時即認為發(fā)芽結(jié)束，最后計算各處理的發(fā)芽率。

1.2.4 種皮、種胚分離相的GC-MS鑒定

分別取鳳丹種子的種皮、種胚各有機相濃縮液100 mL，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮蒸干，得到濃縮的干物質(zhì)，然后再用相應(yīng)的有機溶劑溶解定容至3 mL，即得到各有機相提取物的濃縮樣品。上述濃縮樣品在清華大學(xué)分析中心質(zhì)譜室進行鑒定，鑒定條件如下：氣質(zhì)儀器：GC-MS QP2010 ultra（Shimadzu，Kyoto，Japan）。氣質(zhì)分析方法：柱子 Rxi-5Sil MS（Restek，USA，30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口300 ℃，分流進樣分流比20∶1，載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min。升溫程序：50 ℃保持 5 min，以 5 ℃/min漲至 300 ℃保持30 min。質(zhì)譜條件：離子源：EI；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃，溶劑切除時間：3 min；掃描45～500 m/z。將GC-MS鑒定出的各個成分的質(zhì)譜圖與標準庫譜圖進行核對，確定各個物質(zhì)的名稱、分子式、分子量和相對含量等。

2 結(jié)果與分析

2.1 種皮和種胚各分離相的生物測定

鳳丹種子的種皮、種胚各相提取液對白菜籽發(fā)芽的影響見表1。從表1可知：種子各部位、各相提取液對白菜籽發(fā)芽均有一定的抑制作用，且除石油醚相及種胚乙酸乙酯相外，其他各相均使白菜籽發(fā)芽顯著下降，但種子部位不同、提取相不同，其對白菜籽發(fā)芽率的抑制程度有所不同。種皮提取液中，乙醚相的抑制作用最強，處理后白菜籽幾乎不能發(fā)芽，發(fā)芽率由對照的86.7%下降到0.7%；其次是乙酸乙酯相，發(fā)芽率下降到6.7%，降低了80.0%；甲醇相、水相處理后，發(fā)芽率也有較大程度的下降，分別較對照下降了52.0%、37.4%。種胚部位，仍是乙醚相的抑制作用最強，使白菜籽發(fā)芽率顯著下降到3.3%，甲醇相、水相處理后，白菜籽發(fā)芽率分別顯著下降到44.7%、56.0%，乙酸乙酯相處理后白菜籽的發(fā)芽率為83.4%，較對照差異不顯著。同一提取相中，不同部位對白菜籽發(fā)芽的影響程度也不盡相同，種皮乙酸乙酯相和甲醇相的抑制作用顯著高于種胚，特別是乙酸乙酯相，種皮提取液處理后僅有6.7%的白菜籽能夠發(fā)芽，但種胚的提取液卻使白菜籽發(fā)芽率下降不顯著；乙醚相、水相中，種皮、種胚部位的抑制作用差異不顯著；石油醚相中則是種胚的抑制作用略強于種皮，但二者均較對照差異不顯著?？偟膩碚f，同一提取相，種皮部位的抑制作用略強于種胚。種子不同部位各相生物測定的發(fā)芽率結(jié)果，均是乙醚相的抑制作用最強，因此鳳丹種子的內(nèi)源抑制物可能主要存在于乙醚相中。

表1 鳳丹種子不同部位各相提取物對白菜籽發(fā)芽的影響Table 1 Effects of extracts of P . ostii ‘Fengdan' seeds to the germination of cabbage seeds

2.2 鳳丹種皮各分離相GC-MS鑒定結(jié)果

以抑制作用最強的乙醚相為例，經(jīng)GC-MS分析得到的總離子流色譜圖見圖1，通過質(zhì)譜系統(tǒng)檢索并與標準譜圖進行核對，篩選總離子流色譜圖中峰面積較大、相似度大于80%的有機化合物，將質(zhì)譜圖結(jié)果與計算機檢索譜庫圖比對后，得到了吻合性較好的14種物質(zhì)，見表2。由表2可知，種皮乙醚相中14種有機物主要為酚類物質(zhì)3種（雙酚F、苯酚、2,6-二叔丁基對甲酚），相對含量為12.3%；醇類物質(zhì)2種（beta-谷甾醇、羽扇豆醇），相對含量為10.1%；酸類物質(zhì)2種，棕櫚酸、反油酸，相對含量為6.4%；酰胺類物質(zhì)1種，芥酸酰胺，含量為1.4%，其他物質(zhì)2種，未知物質(zhì)4種。

圖1 鳳丹種皮中乙醚相提取物的離子流程Fig. 1 The ion flow of extract with aether solution in seed coat of P. ostii ‘Fengdan'

按照相同的方法，篩選出種皮其他相中的有機物，見表3。由表3可知，種皮乙酸乙酯相中共鑒定出17種有機化合物，主要為酚類物質(zhì)，其總相對含量為20.3%，主要包括雙酚F、苯酚、鄰苯二酚、間苯三酚，另外還有有機酸類、酰胺類物質(zhì)，如棕櫚酸、苯甲酸、反油酸、芥酸酰胺、油酸酰胺等，還含有少量的6,7-二羥基香豆素[7]（1.1%）。種皮甲醇相也鑒定出17種有機物，主要為酚類和有機酸物質(zhì)，其相對含量較高的為苯甲酸（13.2%）、鄰苯二酚（10.5%）、苯酚（9.4%）、芥酸酰胺（2.6%）等。種皮石油醚相共鑒定出24種物質(zhì)，主要是烷類物質(zhì)其總相對含量為20.4%，還含有棕櫚酸（3.7%）、芥酸酰胺（3.3%）等物質(zhì)。

2.3 種胚分離相的GC-MS鑒定結(jié)果

本次篩選出種胚各有機相中的化合物見表4。種胚乙醚相、甲醇相、乙酸乙酯相和石油醚相分別鑒定出了34、26、24、26種有機化合物，各相鑒定出的物質(zhì)種類數(shù)比種皮部位稍多些。種胚乙醚相中鑒定出的有機化合物相對含量較高的主要是有機酸類（19.9%）及其酯類化合物（18.5%），有機酸類主要為苯甲酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸等，酯類物質(zhì)可能是由于提取及測試過程中某些酸類物質(zhì)發(fā)生了酯化作用造成的，因此有機酸的實際相對含量可能還要高些；另外，該有機相內(nèi)雖然含有2,6-二叔丁基對甲酚、芥酸酰胺、苯酚等物質(zhì)，但是相對含量較低。甲醇相主要為酚類和有機酸類物質(zhì)，酚類物質(zhì)主要為苯酚，其相對含量為8.3%，苯甲酸及其酯化物的總含量為8.8%。乙酸乙酯相中鑒定出的主要為酯類物質(zhì)，存在于該相的酚類物質(zhì)為苯酚、2,6-二叔丁基對甲酚，有機酸類為反油酸、硬脂酸、苯甲酸和棕櫚酸，酰胺類為芥酸酰胺和油酸酰胺，但酚類、有機酸類和酰胺類物質(zhì)含量都只在1%左右。石油醚相中鑒定出的有機化合物主要為酯類（20.1%）、烷類（19.1%）和醇類（13.8%）物質(zhì)，該有機相中也存在甲基苯、酰胺類以及有機酸類物質(zhì)，但是其含量很低。

表2 鳳丹種子種皮乙醚相中的化合物及相對含量Table 2 Compounds and their relative contents in aether extract of P . ostii ‘Fengdan' seed coat

表3 鳳丹種皮各分離相的化合物及相對含量Table 3 Compounds and their relative contents in seed coat extracts of P . ostii ‘Fengdan'

表4 鳳丹種胚各分離相的化合物分類及相對含量Table 4 Compounds and their relative contents in decoated seeds extracts of P . ostii ‘Fengdan'

3 結(jié)論與討論

鳳丹種子萌發(fā)需要較長時間，這與其種子具有深休眠特性有關(guān)[8]。本研究從抑制物角度，探討引起鳳丹種子生理休眠的原因。以往的研究表明，內(nèi)源抑制物的存在是導(dǎo)致許多種子休眠的主要原因之一，如黃精（Polygonatum sibiricum）[9]、烏桕（Sapium sebiferum）[10]、南方紅豆杉（Taxus chinensisvar.mairei）[11]等種子中都含有內(nèi)源抑制物。對鳳丹種子各有機相的生物測定結(jié)果同樣表明，種子中內(nèi)源抑制物質(zhì)的存在可能是導(dǎo)致其休眠的原因之一。

要確定內(nèi)源抑制物的存在，通常采用系統(tǒng)溶劑法對種子的甲醇相提取液進行分離，并結(jié)合各有機相對白菜籽等非休眠植物種子的發(fā)芽實驗進行生物測定。尚旭嵐等[12]采用系統(tǒng)溶劑法對青錢柳（Cyclocarya paliurus）種子的浸提液進行分離，通過生物測定發(fā)現(xiàn)抑制物質(zhì)主要存在于乙醚相中；史鋒厚等[13]對南京椴（Tiliam iqueliana）種子的研究發(fā)現(xiàn)，果皮中的抑制物質(zhì)主要存在于乙醚相和甲醇相中，而種子中的抑制物質(zhì)主要在甲醇分離相中；張艷杰[14]對南方紅豆杉種子的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制物質(zhì)主要存在于種子的乙醚相和甲醇相中。本研究中，對各有機相生物測定結(jié)果比較后發(fā)現(xiàn)，種皮和種胚的乙醚相的抑制作用最強，這和上述研究結(jié)果相似，因此該種子乙醚相鑒定出的物質(zhì)可能與其生理休眠有密切關(guān)系。

以往的研究表明，酚類、有機酸類是植物種子中常見的抑制物質(zhì)，它們通過阻礙種子吸水進程、抑制呼吸作用、抑制生物酶的活性以及阻礙胚根生長等方式，對種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用[15-17]。近年來，發(fā)芽抑制物質(zhì)的分離與鑒定已成為種子休眠機理研究的重要內(nèi)容。

Eiuhellin[18]認為，酚類物質(zhì)能夠抑制種子萌發(fā)所需的關(guān)鍵酶的代謝，最終對種子的萌發(fā)有影響。酚類化合物對植物生長也具有較強的抑制作用，其對水葫蘆的抑制作用主要表現(xiàn)在使水葫蘆葉片失水干枯，根毛變黑，易脫落[19]。錢存夢[20]對烏桕種子休眠的研究中證實了2,6-二叔丁基對甲酚是重要的內(nèi)源抑制物；韓東等[21]發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚對西洋參（Panax quinquefolius）種子萌發(fā)具有重要的抑制作用，劉序等[22]在香榧種子抑制其發(fā)芽和生長的內(nèi)源物篩選研究中，發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚對白菜種子的發(fā)芽率和幼苗生長的抑制作用最強。本次GC-MS檢測結(jié)果表明，對白菜籽發(fā)芽有顯著影響的種皮乙醚相、甲醇相以及種胚的甲醇相中，酚類物質(zhì)的相對含量較高，分別為12.3%、22.6%、9.4%，并且這幾個相中同樣含有苯酚、2,6-二叔丁基對甲酚和鄰苯二酚等酚類內(nèi)源抑制物質(zhì)，因此酚類物質(zhì)可能與該種子休眠有關(guān)。另外，這幾個相中雙酚F的相對含量也比較高，該物質(zhì)在以往的研究中被證明對生物會有毒害作用，如潘芳[23]、任文娟等[24]發(fā)現(xiàn)雙酚F對斑馬魚幼苗具有一定的毒害作用，但其對種子休眠是否有影響還需要進一步研究。

有機酸類物質(zhì)也是已知的內(nèi)源抑制物質(zhì)，王艷華[25]認為苯甲酸、棕櫚酸、硬脂酸等是大山櫻（Prunus sargentii）種子休眠的重要內(nèi)源抑制物質(zhì)。李龍秀等[26]研究發(fā)現(xiàn)苯甲酸對蘿卜種子萌發(fā)及幼苗生長有明顯的抑制作用，表現(xiàn)為高濃度時抑制，低濃度時抑制作用減弱的特點。本次種皮的乙醚相、甲醇相以及種胚的乙醚相、甲醇相中，有機酸相對含量也比較高，分別為6.4%、16.9%、19.9%、4.1%，而且有機酸在實驗過程中容易酯化，因此其實際相對含量可能還要高些。本次抑制作用較強的種胚乙醚相中，苯甲酸的相對含量高達17.4%，同時還含有一定量的棕櫚酸和硬脂酸，這些酸類物質(zhì)可能是該相對白菜籽發(fā)芽抑制較強的重要原因。

徐敬東[27]在對紫藤（Wisteria sinensis）的研究中發(fā)現(xiàn)，提取物芥酸酰胺對真菌活性具有一定的抑制作用，蔡夢可[28]對花梨木（Peterocarpesspp.）類木材的耐腐性機理的研究中也發(fā)現(xiàn)了芥酸酰胺，認為其對真菌的活性有一定抑制作用。酰胺類物質(zhì)中的油酸酰胺也已被證實能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生生理性睡眠[2]。本次各有機相中，除了酚類和有機酸類物質(zhì)，還含有一定量的酰胺類物質(zhì)，因此酰胺類物質(zhì)對牡丹種子萌發(fā)的影響需要深入研究。

GC-MS結(jié)果分析時還發(fā)現(xiàn)，鳳丹種皮乙酸乙酯相中相對含量最多的為酚類，占20.7%，而種胚則以酯類物質(zhì)為多，酚類物質(zhì)的相對含量只有5.7%；而且種皮中有機酸類和酰胺類物質(zhì)的相對含量也高于種胚。表1中種皮乙酸乙酯相對白菜籽發(fā)芽的影響顯著強于種胚（二者的發(fā)芽率分別是6.7%，81.3%），造成這一顯著差異的原因可能也是由于種皮中擁有較多的酚類、有機酸類、酰胺類物質(zhì)。

本實驗在種皮、種胚石油醚相中鑒定出的有機化合物主要為烷類、酯類、醇類等物質(zhì)，結(jié)合表1的生物測定結(jié)果，這些物質(zhì)可能不是造成鳳丹種子休眠的重要內(nèi)源抑制物質(zhì)。此外，種皮石油醚相中有機酸的相對含量達7.0%，但其生物測定的抑制性不高，該相相對含量較高的是棕櫚酸，因此酚類、有機酸類和酰胺類物質(zhì)中，哪些物質(zhì)與鳳丹種子休眠的有關(guān)還需進一步研究。表1生物活性測定結(jié)果中，水相對白菜籽發(fā)芽也具有一定的抑制作用，但由于儀器的限制，水相中具體的抑制物質(zhì)并未能確定出來。

綜上所述，內(nèi)源抑制物的存在是鳳丹種子生理休眠的原因之一，初步分析發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)源抑制物的主要類型可能是酚類、有機酸類及酰胺類物質(zhì)。本研究中乙醚相的抑制作用最強，其可能含有影響種子休眠的主要抑制物質(zhì)。種皮抑制物的主要成分是酚類物質(zhì)，可能是雙酚F、苯酚、鄰苯二酚、2,6-二叔丁基對甲酚等；種胚的主要抑制物質(zhì)是有機酸類物質(zhì)，如苯甲酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸等；一些酰胺類物質(zhì)可能也具有抑制作用。本實驗被鑒定出的物質(zhì)中，有些物質(zhì)的抑制作用已被證實，但其他物質(zhì)是否也能抑制種子萌發(fā)以及和鳳丹種子休眠的關(guān)系有待進一步證實。其中酚類、有機酸類和酰胺類物質(zhì)，哪一類物質(zhì)對鳳丹種子生理休眠起主要作用，以及相互之間對種子生理休眠的作用關(guān)系也有待進一步研究。