蔣 卉，胡志強

(1.泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)公共平臺服務中心，江蘇 泰州 225300；2.泰州學院，江蘇 泰州 225300)

卡維地洛(carvedilol)臨床上用于原發(fā)性高血壓的治療，可單獨使用或與其它抗高血壓藥特別是噻嗪類利尿劑聯(lián)合使用，還可治療有癥狀的充血性心力衰竭，其通過α1-受體阻斷作用和非選擇性的β-受體阻斷作用而引起兩種毛細血管的擴張，減少外周阻力從而降低血壓?？ňS地洛分子結(jié)構(gòu)中含一個手性碳原子，所以有一對對映體，臨床上通常以外消旋體給藥，但研究表明，(R)-(+) Carvedilol和(S)(-) Carvedilol對于α1-受體的拮抗效果相同，但是對于β-受體的阻斷作用，S構(gòu)型比R構(gòu)型強100倍，因此，卡維地洛對映體的拆分對其藥動學研究具有重要作用。

手性拆分是手性藥物開發(fā)的一個熱點，是進行含量測定和藥物代謝動力學研究的基礎(chǔ)[1-2]。已報道的拆分卡維地洛對映體的方法有手性固定相[3]和手性衍生物法等。但手性固定相制備成本高，手性柱使用壽命短，通用性差，柱前衍生化是對手性藥物分離的間接方法，具有成本低、重復性好等優(yōu)點。因此本研究采用柱前衍生化拆分卡維地洛對映體，為該藥的質(zhì)量控制和藥動學提供方法支撐。

1 試藥與儀器

1.1 儀器

高效液相色譜儀(HP1050，美國惠普公司)；熒光檢測器(1046A，美國惠普公司)；pH儀(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司，精度0.1 mg)。

1.2 試藥

(R)-(+) Carvedilol、(S)-(-) Carvedilol標準品(Dikma 公司)；卡維地洛外消旋體標準品(上海百世凱化學科技有限公司)；2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖異硫氰酸(GITC，sigma公司)；乙腈、甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)；DMSO(細胞培養(yǎng)專用，sigma公司)；磷酸、磷酸氫二鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配置

(R)-(+) Carvedilol、(S)-(-) Carvedilol和GITC 分別用乙腈配置成母液，貯存于冰箱；稱取卡維地洛外消旋體對照品10 mg，用DMSO溶解、超聲、并定容至100 mL容量瓶，得到儲備溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱(4. 6 mm×150 mm, 5 μm)，流動相：乙腈-0.02 mol/L磷酸氫二鈉(25∶75)，以分析純磷酸調(diào)pH值至4.3，柱溫：35℃，流速：1.0 mL/min，熒光檢測激發(fā)波長：285 nm，發(fā)射波長：340 nm，進樣量：5 μL。

2.3 樣品制備

正常人肝上皮細胞L02(廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究中心惠贈)，用DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板(1.0×106～1.5×106細胞/孔)中，加入卡維地洛外消旋體溶液，在37℃、5%CO2，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.4 樣品處理

取樣品上清液400 μL，加入2 mL二氯甲烷，旋渦10 s，離心5 min，取上清液100 μL加入100 μL GITC(50 μg/mL)溶液，蓋緊瓶塞，渦旋混合l min，室溫放置反應2 h后，取5 μL進樣。

2.5 方法特異性考察

分別取不同的細胞培養(yǎng)液加入卡維地洛消旋體樣品，按“樣品處理”項下處理，進樣，考察其特異性。卡維地洛與細胞液中其他內(nèi)源性雜質(zhì)峰分離良好，(R)-(+) Carvedilol保留時間3.63 min，(S)-(-) Carvedilol 4.77 min。色譜圖見圖1。

Chromatographic conditions: Hypersil BDS C18column with acetonitrile sodium/dihydrogen phosphate buffer solution(25/75, v/v) as mobile phase，pH 4.3

圖1 色譜圖

Fig.1 Chromatogram of the separation of

the enantiomers of carvedilol

2.6 標準曲線的制備

取空白細胞培養(yǎng)液200 μL，加入(R)-(+) Carvedilol、(S)-(-) Carvedilol 標準品溶液200 μL，使卡維地洛終濃度為1.0，2.0，4.0，10.0，20.0，40.0 mg/L，按“樣品處理”項下衍生化后操作，以濃度C(mg/L) 為橫坐標，卡維地洛衍生物峰面積A為縱坐標進行線性回歸，R異構(gòu)體得回歸方程為A=4600.3+5748.6C(r = 0.9999)，S異構(gòu)體得回歸方程A=4642.9+6211.3C(r = 0.9996)。

2.7 檢測限實驗

取卡維地洛消旋體溶液，逐步稀釋后，按“樣品處理”項下衍生化后操作，測得最低檢測限為0.066 mg/L。

2.8 精密度與回收率考察

200 μL空白細胞培養(yǎng)液中加入濃度為10.0，20.0，30.0 mg/L的卡維地洛異構(gòu)體標準溶液200 μL，得分別為5.0，10.0，15.0 mg/L 的高、中、低3種濃度樣品，按“樣品處理”項下衍生化后操作，計算日內(nèi)及日間RSD，考察方法的精密度及回收率。結(jié)果見表1 。

表1 精密度和回收率實驗結(jié)果(n=5)

3 討論

3.1 衍生化條件的選擇

手性藥物柱前衍生化拆分的實驗過程中，溶劑的影響是明顯的，因為許多溶劑可阻止衍生反應的發(fā)生或使反應不完全，導致回收率較低。因此，本實驗中選用惰性較好的乙腈作為最佳的提取溶劑，其分子中沒有和衍生劑反應的活性基團。

GITC的濃度、反應時間對衍生化的影響。GITC是一種非?；顫姷漠惲蚯杷狨ヮ愌苌噭?，在室溫下即可與反應化合物側(cè)鏈上的氨基進行化學反應，得到穩(wěn)定的非對映異構(gòu)的硫脲衍生物。實驗考察了不同濃度的GITC對衍生化反應的影響。GITC濃度過低時，衍生化反應不完全，隨著衍生化試劑的增加，卡維地洛衍生物峰面積逐漸增大。但當GITC的摩爾量大于Carvedilol的4倍以上時，繼續(xù)增大GITC濃度，衍生化產(chǎn)物的峰面積不再增加。同樣，反應溫度也影響著衍生化反應，在其他條件相同的情況下，實驗考查了室溫、40℃、50℃和60℃水浴條件下反應衍生物的生成量，結(jié)果表明，隨著反應溫度的升高，衍生化產(chǎn)物峰面積反而下降，室溫時最佳。在上述最佳條件下，考查最佳反應時間，結(jié)果顯示，結(jié)果顯示，在反應開始后的1 h內(nèi)，衍生物增長迅速；2 h時，衍生化產(chǎn)物峰面積達到最大，繼續(xù)延長反應時間，衍生化產(chǎn)物的峰面積不再增加，故選定反應時間為2 h。

GITC結(jié)構(gòu)對衍生化反應的影響。GITC結(jié)構(gòu)中反應基團異硫氰基與空間位阻較大的全乙?；?D-葡萄糖基直接相連，與底物的空間位阻作用對衍生化反應有顯著影響?？ňS地洛結(jié)構(gòu)中氨基與苯環(huán)之間隔2個碳原子，與GITC的空間位阻作用小，可以順利發(fā)生衍生化反應，得到非對映異構(gòu)體衍生物。GITC結(jié)構(gòu)中的全乙?；?D-葡萄糖基具有剛性及親脂性強的特點，在選定的色譜條件下，GITC的大分子結(jié)構(gòu)在色譜分離中起主要作用。

3.2 卡維地洛外消旋體經(jīng)人肝細胞代謝后的代謝選擇差異

當將卡維地洛外消旋體加入人肝細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h以后，我們測定兩種對映體的含量，實驗結(jié)果顯示，經(jīng)培養(yǎng)后，R異構(gòu)體的含量要高于S異構(gòu)體，說明體外代謝，S異構(gòu)體的代謝量比R異構(gòu)體大，卡維地洛的代謝存在立體選擇性。同時也反映了本實驗所建立的方法是可行的，且成本低、分離效果好，可滿足卡維地洛對映體的拆分及檢測。