肖珍科，黎賢泰，王 保，堯新華，張立賢

1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科(廣州 510130)；2.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院麻醉科(廣州 510220)

麝香是許多名貴特效急救中成藥如安宮牛黃丸、局方至寶丹等發(fā)揮藥效所不可或缺的主要藥味，它具有開(kāi)竅、醒神、活血通絡(luò)、消腫止痛的功效，主治熱病神昏、中風(fēng)痰厥等證，麝香酮是天然麝香的主要有效成分。目前的研究表明，麝香酮對(duì)腦損傷有明確療效，本研究設(shè)計(jì)對(duì)大鼠CIRI模型腹腔灌注麝香酮，檢測(cè)灌注前后大鼠測(cè)定海馬組織中S100β、NF-κB p65 活性值的變化，觀察麝香酮對(duì)CIRI的干預(yù)效果。

資料和方法

1 一般資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：采用健康SD老年大鼠60只(廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(粵)20130034)。隨機(jī)分為缺血再灌注組(CIRI)，麝香酮組(SXT)和生理鹽水對(duì)照組(CON)。CIRI即腦缺血再灌注損傷模型組，大鼠腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，麻醉后于大鼠頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，用小動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min后打開(kāi)動(dòng)脈夾，再灌注2 h，斷頭處死大鼠。SXT即麝香酮組，提前2 h對(duì)SD老年大鼠腹腔注射麝香酮溶液(3.6 mg/kg)，每小時(shí)注射一次，后造CIRI大鼠模型。CON表示SD老年大鼠灌胃給予生理鹽水，其余操作同SXT。處死大鼠后取海馬區(qū)腦組織，采用凝膠電泳遷移分析法測(cè)定海馬組織中S100β、NF-κB p65活性值。實(shí)驗(yàn)分兩次完成，每次完成30只大鼠實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：垂直電泳儀及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(BIO RAD)、射線攝影暗匣(5X7英寸富士X光片發(fā)光暗盒，廣州藝佳生物)、脫色搖床(Rotomix公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑：蛋白提取液(碧云天生物)、十二羥硫酸鈉(SDS)(廣州威佳)、二硫蘇糖醇(DTT)(Sigma)、甘油(國(guó)產(chǎn))、丙烯酰胺(Sigma)、N，N-亞甲基丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)(Sigma)、四甲基乙二胺(TEMED)(上海生工)、過(guò)硫酸銨(AP)(廣州化學(xué)試劑廠)、甘氨酸(鼎國(guó))、Tris堿(Sigma)、甲醇(廣州化學(xué)試劑廠)、Tween-20(Sigma)、脫脂奶粉(伊利)、PVDF膜(BIO RAD)、一抗S100β(ABCAM，AB52642，1：4000)、一抗NF-κB(ABCAM，AB16502，1：2000)、羊抗兔IgG/HRP(BA1055博士德)、羊抗小鼠IgG/HRP(BA1051博士德)、β-actin(3700 CST)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

2.1 溶液的配制：①30%丙烯酰胺 100 ml。②1.5 mol/L pH8.8Tris-HCL 100 ml。③1.0 mol/L pH6.8Tris-HCL 100 ml。④10%SDS 100 ml。⑤10%過(guò)硫酸銨100 ml。⑥TEMED購(gòu)自成品。⑦2 X SDS凝膠加樣緩沖液。⑧1 mol/L DTTl。⑨脫色液 100 ml。⑩Tris-甘氨酸電泳緩沖液 1000 ml；染色液180ml。

2.2 凝膠的配制 一般配制凝膠濃度為12%。先配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠，加入TEMED后，再配制成濃縮膠。

2.3 樣品的前處理：裂解后的樣品離心后進(jìn)行BCA蛋白定量測(cè)定。

2.4 免疫印跡：上樣與電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，發(fā)光顯影，得到顯影條帶。

3 觀察項(xiàng)目 記錄每組所顯影的條帶，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

結(jié) 果

麝香酮能降低CIRI大鼠海馬區(qū)腦組織的S100β、NF-κB p65活性值，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠海馬區(qū)腦組織的S100β、NF-κB p65含量比較

注：與空白組比較，◇P<0.01；與對(duì)照組比較，◆P<0. 05

討 論

S100β蛋白是構(gòu)成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞液的主要成份，當(dāng)腦損傷尚處于無(wú)癥狀的亞臨床狀態(tài)時(shí)，結(jié)構(gòu)上受損的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋出S100β進(jìn)入腦脊液。這說(shuō)明在對(duì)腦損傷的檢測(cè)中，S100β有較高的特異性[1-3]。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB (NF-κB) 是普遍存在于真核細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)錄因子，具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，1986 年首先發(fā)現(xiàn)它是 B 淋巴細(xì)胞中免疫球蛋白 κ輕鏈轉(zhuǎn)錄所需的核轉(zhuǎn)錄因子，故命名 NF-κB[4]。NF-κB參與多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。腦缺血再灌注可導(dǎo)致NF-κB的激活在許多研究中都已得到證實(shí)。NF-κB 表達(dá)部位與缺血時(shí)間有關(guān)[5-6]。而敲除P65基因的小鼠在同樣條件下的缺血性腦損傷明顯減輕，說(shuō)明NF-κB 在腦缺血中具有促進(jìn)細(xì)胞損傷的作用[7]。近年來(lái)，NF-κB 的活化被認(rèn)為是介導(dǎo)和加劇 CIRI的重要環(huán)節(jié)，并開(kāi)始初步探討阻斷NF-κB 激活過(guò)程保護(hù)腦組織[8]。正常情況下，在大腦皮層和海馬區(qū)域，NF-κB與其抑制蛋白 IκB 結(jié)合，處于低水平狀態(tài)。腦缺血再灌注后，氧化應(yīng)激的產(chǎn)生導(dǎo)致白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α 等細(xì)胞因子增多，通過(guò)與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，引起信號(hào)在胞質(zhì)內(nèi)的釋放和傳導(dǎo)[9]，最終導(dǎo)致 IκB 在 IκB 激酶( IκB ki-nase，IKK) 的作用下發(fā)生磷酸化而降解，與 NF-κB解離，游離NF-κB p65 迅速由細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核，與多種基因的啟動(dòng)子部位 κB 位點(diǎn)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)、黏附分子、生長(zhǎng)因子等[10]。通過(guò)抑制 CIRI 大鼠NF-κB 的表達(dá)，或者降低局灶性 CIRI 大鼠NF-κB p65的活化，調(diào)控NF-κB p65 信號(hào)通路上的關(guān)鍵信號(hào)分子，從而改善大腦缺血所致的神經(jīng)元凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷[11-13]。

麝香酮(3-甲基環(huán)十五烷酮)是人工麝香中的主要活性成份，具有抗癡呆、抗腦缺血、抗炎等多方面藥理作用。研究證明麝香酮對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞缺氧缺糖和再給氧損傷具有顯著的保護(hù)作用，提示麝香酮有可能用于中風(fēng)病急性期的治療[14]；它能明顯縮小腦缺血再灌注損傷模型大鼠的腦梗塞體積，減輕腦缺血再灌注所引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制主要為[15-19]：增加大腦組織SOD含量，降低MDA含量，減輕缺血、缺氧造成的興奮性氨基酸含量，抑制興奮性氨基酸導(dǎo)致的興奮性神經(jīng)毒性；抑制谷氨酸通過(guò)N-甲基-D-門(mén)冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的神經(jīng)元內(nèi) Ca2+超載，降低乳酸脫氫酶(LDH)釋放，穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜電位；減少谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAC1 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，減輕興奮毒性，抑制氧化損傷，減少EEACl mRNA 表達(dá)，抑制NMDA受體的激活，抑制 Ca2+-Ca MKII和ASK-1/JNK/p38 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族的表達(dá)等；還可以通過(guò)刺激交感神經(jīng)興奮，使腦動(dòng)脈中的β受體興奮，腦血管緊張度降低，彈性改善，血管擴(kuò)張，促使腦血流量增加，使腦組織氧含量和能量代謝等得到充分改善，從而保護(hù)腦缺血后神經(jīng)元的損傷。另外，大鼠局灶性腦缺血損傷模型大鼠給予麝香酮后，能減輕缺血、缺氧造成的血腦屏障通透性改變，減少蛋白質(zhì)漏出，從根本上降低腦細(xì)胞的水腫程度，并對(duì)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡發(fā)生影響，防止腦缺血病程發(fā)展，從而發(fā)揮對(duì)腦缺血保護(hù)作用[20-21]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果SXT與CIRI比較，S100β及NF-κB p65蛋白相對(duì)灰度明顯下降，表明麝香酮能明顯降低CIRI模型大鼠的S100β和NF-κB p65值，提示麝香酮抗CIRI的作用與減少S100β蛋白釋放，減少NF-κB蛋白表達(dá)，減輕興奮性氨基酸毒性有關(guān)，說(shuō)明麝香酮腹腔內(nèi)灌注對(duì)POCD可能有一定的預(yù)防效果。

SXT與CON比較，S100β的變化有明顯差別，而NF-κB p65的變化無(wú)明顯差別，提示中藥方劑的起效方式較復(fù)雜，其中單味藥材有效成分所起的作用有限，還需要做進(jìn)一步研究。