黃進(jìn)寶 李紅艷 蘭長青 呂驍 林志來 王新航 張宏英 鄒盛華 翁恒

(1.福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院福建省福州肺科醫(yī)院呼吸內(nèi)科；2.影像科；3.檢驗(yàn)科，福州 350008)

肺隱球菌病(pulmonary cryptococcosis，PC)的傳統(tǒng)診斷方法主要包括真菌病原體檢測和肺組織病理活檢，由于呼吸道標(biāo)本的隱球菌檢出率低，并且培養(yǎng)周期較長[1]，并不能滿足臨床的診斷需要，目前確診仍主要依賴病理學(xué)。近年來，新生隱球菌莢膜多糖抗原(cryptococcal capsular polysaccharide antigen，CrAg)檢測作為一種無創(chuàng)檢驗(yàn)方法，在協(xié)助快速診斷隱球菌感染方面已取得了明顯進(jìn)展，但目前研究主要集中于隱球菌腦膜炎(cryptococcal meningitis，CM)患者，在PC中的研究并不多，且多數(shù)觀察例數(shù)較少[2-5]，缺乏代表性。本研究采用酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)和側(cè)流免疫層析法(Lateral flow assay，LFA)兩種方法對(duì)疑似PC患者的血清CrAg進(jìn)行檢測，探討ELISA 檢測CrAg的最佳截?cái)嘀?cut-off)，并比較ELISA和LFA的診斷效率。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

采集2016年1月至2018年6月福建省福州肺科醫(yī)院109例疑似PC患者的血液，采用ELISA和LFA兩種方法對(duì)血清CrAg進(jìn)行檢測。根據(jù)2010年國內(nèi)隱球菌感染診治專家共識(shí)PC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，經(jīng)肺組織病理學(xué)檢查或肺穿刺液病原學(xué)檢測確診為PC53例，其中男性33例，女性20例，年齡15～80歲，其中21例存在一種或一種以上基礎(chǔ)疾病(其中16例存在免疫抑制基礎(chǔ)疾病)，包括乙肝或乙肝病毒攜帶者、糖尿病、鼻咽癌放療后、乳腺癌術(shù)后放化療后、直腸癌術(shù)后、惡性淋巴瘤化療后、膜性腎病激素治療后、視神經(jīng)脊髓相關(guān)性視神經(jīng)炎激素治療后、陳舊性肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎治療史、隱性梅毒、低球蛋白血癥、高血壓病、高脂血癥、高尿酸血癥。肺部其他病變56例，其中男性34例，女性22例，年齡17～92歲，包括肺結(jié)核19例(其中2例合并結(jié)核性腦膜炎)，肺炎17例，肺腫瘤8例，肺膿腫4例，機(jī)化性肺炎3例，間質(zhì)性肺炎合并肺奴卡菌病1例，塵肺2例(其中1例合并肺炎)，非結(jié)核分支桿菌肺病2例(其中1例合并肺曲菌球)，其中15例同時(shí)存在一種或一種以上肺外基礎(chǔ)疾病，包括乙肝病毒攜帶者、糖尿病、視神經(jīng)脊髓相關(guān)性視神經(jīng)炎、右側(cè)頜下腫物、甲狀腺腫物、陰道腫物、高血壓病、高尿酸血癥、高脂血癥。

1.2 儀器和試劑

隱球菌莢膜多糖定量檢測酶聯(lián)免疫層析法試劑盒，由丹娜(天津)生物科技有限公司提供。側(cè)流免疫層析法試紙條(CrAg LFA)為美國Immuno-Mycologics，Inc公司產(chǎn)品，已由美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)。BACTEC9120全自動(dòng)血培養(yǎng)儀購自美國BD公司。

1.3 血清標(biāo)本采集

采集患者空腹肘靜脈血約3 mL，1600×g離心10 min取血清，血清標(biāo)本保存于-80℃冰箱備用。

1.4 血清CrAg檢測方法

ELISA檢測方法[7]配制工作洗滌液；取待測血清標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)曲線組樣本各300 μL，分別加入100 μL樣本處理液混勻，放入水浴鍋100℃加熱3 min后，4℃，10000 g離心10 min；分別取60 μL加入混合板孔，再加入酶標(biāo)抗體60 μL混合，封板，37℃下孵育30 min；然后每孔轉(zhuǎn)移100 μL至酶標(biāo)板孔，設(shè)空白對(duì)照l孔，加入樣本稀釋液100 μL，封板，37℃下孵育30 min；揭開封板膜，洗滌酶標(biāo)板，每孔每次加入不少于300 μL的洗液，洗滌5次，再每孔加底物溶液100 μL，37℃避光孵育15 min后每孔加50 μL終止液，加樣順序與加底物順序相同，混勻后在450 nm處讀吸光度(A)值。各孔A值減去空白對(duì)照A值后分析。以莢膜多糖濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，作Logistic回歸分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣本中莢膜抗原濃度(μg/L)。血清CrAg濃度陽性截?cái)嘀党醵? μg/L。

LFA法 將1滴樣本稀釋液加入到無菌試管中，取40 μL血清樣本混合，將隱球菌抗原檢測試紙條的白端沒人樣本液中，10 min后讀取結(jié)果。出現(xiàn)兩個(gè)條帶(檢測條帶和對(duì)照條帶)為陽性；僅出現(xiàn)對(duì)照條帶為陰性；若對(duì)照條帶未出現(xiàn)，說明檢測失敗，重新檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 LFA和ELISA檢測PC組與非PC組血清CrAg的結(jié)果比較(見表1)

應(yīng)用LFA方法，PC組血清CrAg檢測陽性率明顯高于非PC組，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。應(yīng)用ELISA方法，PC組血清CrAg濃度為[11.43(5.92，47.96)] μg/L，其中CrAg≤3.2 μg/L的例數(shù)明顯低于非PC組，而CrAg≥5.0 μg/L的例數(shù)則明顯高于非PC組，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 LFA和ELISA檢測PC組與非PC組血清CrAg的結(jié)果比較

注：LFA：側(cè)流免疫層析法；ELISA：酶聯(lián)免疫分析法，CrAg：新生隱球菌莢膜多糖抗原；PC：肺隱球菌?。?：P< 0.05

2.2 ELISA檢測血清CrAg的最佳截?cái)嘀?/h3>

采用ELISA檢測血清CrAg時(shí)不同截?cái)嘀邓鶎?duì)應(yīng)的敏感度、特異度、約登指數(shù)、PPV及NPV見表2。應(yīng)用ROC曲線分析顯示曲線下面積0.939(95%可信區(qū)間0.892～0.985，P=0.024)，見圖1。其中截?cái)嘀禐?.54 μg/L時(shí)約登指數(shù)最高，視為最佳截?cái)嘀担瑢?duì)應(yīng)的敏感度、特異度、PPV及NPV分別為94.3%、80.4%、82.0%和93.8%。

2.3 LFA和ELISA檢測血清CrAg診斷PC效率的比較(見表3)

LFA診斷PC的敏感度、特異度、PPV和NPV分別為83.%、98.2%、97.8%和85.9%。

當(dāng)血清CrAg以4.0 μg/L為截?cái)嘀禃r(shí)，ELISA和LFA的診斷敏感度(88.7%和83.0%)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但ELISA特異度(82.1%)明顯低于LFA(98.2%)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

當(dāng)血清CrAg分別取5.0 μg/L、6.0 μg/L和7.0 μg/L為截?cái)嘀禃r(shí)，ELISA和LFA的診斷敏感度及特異度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

圖1酶聯(lián)免疫分析法檢測血清隱球菌莢膜多糖抗原的受試者工作特征曲線圖

Fig.1Receiver Operating Characteristic (ROC) curve of serum cryptococcal capsular polysaccharide antigen detected by ELISA

表2 ELISA檢測血清CrAg不同截?cái)嘀翟\斷PC的效率(%)

注：ELISA：酶聯(lián)免疫分析法；PC：肺隱球菌病；*受試者工作特征曲線所得最佳截?cái)嘀?；括?hào)內(nèi)為例數(shù)

表3 LFA和ELISA檢測血清CrAg診斷PC效率的比較

注： LFA：側(cè)流免疫層析法；ELISA：酶聯(lián)免疫分析法；CrAg：新生隱球菌莢膜多糖抗原；PC：肺隱球菌??；括號(hào)內(nèi)為例數(shù)；a：與LFA比較；b：ROC曲線所得最佳截?cái)嘀?；c：P< 0.05；—：采用Fisher確切概率法，無統(tǒng)計(jì)值

當(dāng)血清CrAg取8.0 μg/L為截?cái)嘀禃r(shí)，ELISA的診斷敏感度(62.3%)明顯低于LFA(83.0%)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩者特異度(100%和98.2%)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 血清CrAg檢測出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果的患者基礎(chǔ)疾病情況

應(yīng)用LFA檢測，PC組9例(17.0%)出現(xiàn)假陰性，其中1例合并惡性淋巴瘤和乙肝，1例合并乙肝病毒攜帶者和高脂血癥，非PC組1例(1.8%)出現(xiàn)假陽性(弱陽性)，基礎(chǔ)病為肺結(jié)核；應(yīng)用ELISA檢測(以血清CrAg≥5 μg/L定為陽性)，PC組8例(15.1%)出現(xiàn)假陰性，其中1例合并惡性淋巴瘤和乙肝，1例合并乙肝，非PC組6例出現(xiàn)假陽性，但所有結(jié)果均小于7 μg/L，其中僅1例大于6 μg/L?；A(chǔ)疾病包括肺結(jié)核3例(其中1例同時(shí)LFA假陽性，合并頜下腫物和高尿酸血癥，1例合并塵肺)，塵肺合并高脂血癥和高尿酸血癥1例，機(jī)化性肺炎2例(其中1例合并高脂血癥和高尿酸血癥)。

2.5 PC患者血清CrAg動(dòng)態(tài)監(jiān)測結(jié)果

14例患者在抗真菌治療過程中監(jiān)測血清CrAg濃度變化，治療前莢膜抗原濃度為[19.33(7.11，43.46)] μg/L，治療后6個(gè)月莢膜抗原濃度為[8.09(5.39，11.90)] μg/L，較前明顯下降，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.976，P=0.048)。其中8例治療后6個(gè)月同時(shí)應(yīng)用LFA復(fù)查血清CrAg，僅1例(12.5%)轉(zhuǎn)為陰性，其余7例(87.5%)仍呈陽性。有兩例在治療前莢膜濃度分別為8.0 μg/L和8.9 μg/L，在治療過程中均出現(xiàn)莢膜抗原濃度一度升高，前者在第3個(gè)月升至10.15 μg/L，后者在治療第6個(gè)月升至12.87 μg/L，但肺內(nèi)病灶均吸收改善，經(jīng)繼續(xù)治療后再度出現(xiàn)下降，第9個(gè)月復(fù)測均低于5.0 μg/L。

3 討 論

莢膜是新生隱球菌重要的毒力因子，莢膜多糖能夠脫離菌體，分布于菌體所生長的外界環(huán)境中[8]，因此對(duì)體內(nèi)的CrAg進(jìn)行檢測可協(xié)助隱球菌感染的診斷。目前報(bào)道的血清CrAg檢測方法主要包括乳膠凝集試驗(yàn)(latex agglutination test，LA)和LFA[2-5,9,10]。國內(nèi)有研究表明[7]，ELISA檢測腦脊液CrAg診斷CM的敏感度和特異度均達(dá)100%，與LA和LFA的診斷價(jià)值相當(dāng)。國外也有報(bào)道顯示[11]，ELISA檢測人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染患者血清和腦脊液CrAg對(duì)診斷隱球菌感染有很好的敏感度和特異度，與LA診斷效果類似。目前有關(guān)ELISA檢測血清CrAg在非HIV感染宿主PC患者中的診斷價(jià)值國內(nèi)外少有文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，PC患者的血清CrAg陽性率和莢膜抗原濃度均明顯高于非PC患者，LFA和ELISA兩種檢測方法的診斷結(jié)論一致。其中應(yīng)用LFA診斷PC的敏感度和特異度分別為83.%和98.2%，與付雅婕等[12]和胡群等[13]的研究結(jié)果一致，但敏感度明顯低于Baughman等[14]的報(bào)道，考慮與后者均為HIV患者，而本組均為非HIV患者，且大部分患者無確切免抑制基礎(chǔ)疾病，釋放入血的隱球菌抗原較少有關(guān)[13]。同時(shí)，ELISA檢測的ROC曲線分析顯示，ELISA對(duì)PC患者同樣有較高的診斷價(jià)值，3.54 μg/L為最佳截?cái)嘀?，其敏感度和NPV均較高，分別達(dá)94.3%和和93.8%，但特異度較低(80.4%)。隨著診斷截?cái)嘀瞪?，ELISA診斷PC的特異度明顯提高，當(dāng)CrAg≥7 μg/L時(shí)特異度可達(dá)100%，但敏感度明顯下降，當(dāng) CrAg≥8 μg/L時(shí)ELISA的診斷敏感度僅62.3%，明顯低于LFA(P<0.05)。當(dāng)以5.0 μg/L為截?cái)嘀禃r(shí)，ELISA和LFA均有較好的敏感度和特異度，并且兩種診斷方法效率相當(dāng)。

目前的研究多集中于CrAg對(duì)隱球菌感染的診斷作用，有關(guān)CrAg協(xié)助療效判斷的研究較少[7,13]。季淑娟等[7]對(duì)CM患者抗真菌治療前后的腦脊液CrAg進(jìn)行半定量對(duì)比檢測發(fā)現(xiàn)，LA和ELISA兩種方法均顯示隨著治療時(shí)間延長，患者的腦脊液莢膜抗原濃度總體逐漸下降，與臨床轉(zhuǎn)歸相符。胡群等[13]的研究也顯示，采用LFA對(duì)HIV陰性PC患者的血清CrAg進(jìn)行半定量動(dòng)態(tài)監(jiān)測，患者的抗原滴度隨著病情好轉(zhuǎn)逐漸下降。本研究采用ELISA監(jiān)測PC患者血清CrAg含量變化，結(jié)果同樣表明，患者經(jīng)過抗真菌治療后隱球菌抗原含量整體呈明顯下降趨勢(shì)，與患者的臨床癥狀改善和肺部病灶吸收好轉(zhuǎn)大體一致，提示ELISA檢測方法有助于判斷PC臨床轉(zhuǎn)歸。雖然LFA、LA和ELISA 3種檢測方法均可對(duì)抗原含量進(jìn)行半定量測試有助于療效判斷，但LA和LFA兩種方法是通過對(duì)陽性標(biāo)本進(jìn)行反復(fù)稀釋，以抗原滴度高低來表示抗原含量[7,13]，不僅操作繁雜，而且對(duì)操作人員的檢測經(jīng)驗(yàn)要求高，而ELISA則是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣本中的莢膜抗原濃度，以具體的抗原含量來表示，類似定量檢測，檢測結(jié)果更為直觀，能更好的反映不同標(biāo)本間的抗原濃度差異及不同時(shí)間點(diǎn)的抗原含量變化，比LFA和LA更有優(yōu)越性[15]。此外，本研究也顯示，PC患者治療后采用LFA定性檢測復(fù)測血清CrAg多數(shù)結(jié)果仍呈陽性，考慮與死亡的隱球菌菌體仍可釋放莢膜多糖抗原，而機(jī)體清除抗原較慢有關(guān)[16]，因此LFA定性檢測不適用于判斷PC療效。

在莢膜抗原檢測干擾因素方面，既往研究表明[17]，LFA檢測血清CrAg特異度高，很少出現(xiàn)交叉反應(yīng)，主要在血清曲霉菌半乳甘聚糖檢測陽性標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)存在交叉陽性。在本實(shí)驗(yàn)中，LFA特異度同樣高達(dá)98.2%，僅1例肺結(jié)核出現(xiàn)假陽性，但ELISA檢測出現(xiàn)6例假陽性(以檢測值≥5 μg/L為陽性)，其中3例為肺結(jié)核，而有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用LA檢測結(jié)核患者的血清CrAg同樣存在假陽性[18]，提示應(yīng)用LFA和ELISA檢測血清CrAg時(shí)，肺結(jié)核對(duì)檢測結(jié)果可能造成干擾從而出現(xiàn)假陽性，尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，通過本研究表明，當(dāng)血清CrAg取3.54μg/L時(shí)為ELISA檢測的最佳截?cái)嘀?，但?dāng)取5.0 μg/L為截?cái)嘀禃r(shí)，ELISA同時(shí)有較好的敏感度和特異度，且和LFA的診斷效率相當(dāng)，兩種方法均有助于對(duì)PC的快速臨床診斷，值得臨床推廣應(yīng)用。與LFA定性檢測相比，ELISA可動(dòng)態(tài)監(jiān)測血清CrAg的濃度變化，有助于PC的療效判斷和預(yù)后評(píng)估。