王星 張瑜 馬列婷

多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一種惡性漿細胞疾病，屬于B細胞淋巴瘤的一種，是骨髓漿細胞異常增殖性疾病。常常伴隨有高鈣血癥、貧血、多發(fā)性溶骨性、腎臟等損害。患者患病后正常的免疫球蛋白的生成障礙，較為容易發(fā)生感染。發(fā)病早期無特異性臨床癥狀，容易造成漏診和誤診。多發(fā)生于中老年患者，若得不到及時治療，嚴重威脅患者生命安全。臨床診斷MM的方法較多，有影像學(xué)檢查、臨床癥狀及實驗室檢查等[1]。伴隨著流式細胞術(shù)的不斷發(fā)展，以客觀、靈敏及快速的優(yōu)勢，在MM診斷中有較高應(yīng)用價值，在病情檢測、療效評價及預(yù)后判斷中有重要作用。本文通過收集我院56例MM患者，分析流式細胞術(shù)免疫分型對MM的診斷價值對比。

1 對象與方法

1.1 對象

抽取我院2016年1月—2018年12月收治的56例MM患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》中的標(biāo)準(zhǔn)[2]；簽署知情同意書，自愿參與此次研究，經(jīng)我院醫(yī)學(xué)理論會同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴重心肝腎功能障礙基礎(chǔ)性疾??；其他血液系統(tǒng)疾??；精神病。

男34例，女22例；年齡43～71歲，平均（58.78±5.34）歲；組織器官損害：7例血鈣增高，31例腎功損害，43例貧血，46例骨病變。DS分期：ⅠA 5例，ⅠB 7例，ⅡA 10例，ⅡB 17例，ⅢA 10例，ⅢB 7例。

1.2 研究方法

所有患者均給予骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢查、流式細胞術(shù)檢查、毛細管免疫分型電泳、毛細管血清蛋白電泳。

（1）骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢查：抽取0.2 mL脊髓液，涂片、晾干、染色、去染、晾干，于涂片、染色良好體尾交界處按照一定順序分類計數(shù)200個有核細胞，從而計算骨髓瘤細胞百分比。陽性標(biāo)準(zhǔn)：骨髓漿細胞超過10%。

（2）流式細胞術(shù)：采用Epics Eliet流式細胞儀，抽取2 mL肝素抗凝骨髓液，選擇5～10×106細胞/mL單細胞懸液，每100 μL單細胞懸液與20 μL好的抗體室溫避光孵育20分鐘，加入氯化銨溶血劑維持液體。按照1 500 rpm，離心10 min，去除上清，并采用0.5 mL PBS重懸后上機，PBS洗滌2遍、避光破膜15 min，加入胞漿抗體孵育30 min，洗滌1次后采用0.5 mL PBS重懸。采用BD FACSDiva軟件獲取、記錄及分析數(shù)據(jù)。每管分析10 000個細胞，將熒光強度軸設(shè)定為對數(shù)模式，并以CD45/SSC聯(lián)合CD38/CD138設(shè)門分析評估骨髓取材。用于多發(fā)性骨髓瘤細胞免疫分型的抗體有CD45，CD38，CD138，CD19，CD56，胞內(nèi)Kappa輕鏈，胞內(nèi)labda輕鏈。收集CD38＋＋／CD45-／＋細胞10 000個，利用同型對照設(shè)置Cut Off值，細胞群在某一抗原軸方向整體位移超出Cut Off線≥20%判定為該抗原表達陽性。

（3）毛細管免疫分型電泳：促凝全血標(biāo)本3 000 r/min離心15分鐘分離血清，樣本同配套試劑一同放入全自動毛細管電泳儀上反應(yīng)、電泳、掃描及判定結(jié)果。每個樣本進行6次血清蛋白電泳，其中一次為標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白電泳，另外五次為加入抗IgM、IgA、IgG、k、γ抗體反應(yīng)后的電泳。陽性標(biāo)準(zhǔn)：在標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白電泳圖形中出現(xiàn)底部狹窄、高尖的異常蛋白峰，在加入抗IgM、IgA、IgG、k、γ抗體后的電泳圖形中，如出現(xiàn)異常蛋白峰的消失則為相應(yīng)類型的克隆性Ig。

（4）毛細管血清蛋白電泳：用Sebia Capillarys全自動毛細管電泳儀及配套試劑，促凝全血標(biāo)本3 000 r/min離心15分鐘分離血清，在全自動毛細管電泳儀上電泳分離、掃描及判定結(jié)果。陽性標(biāo)準(zhǔn)：掃描圖中α、β、γ區(qū)域底部狹窄，高尖的異常蛋白峰為陽性。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）記錄MM患者骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢查、流式細胞術(shù)通過CD45/SSC聯(lián)合CD38/CD138設(shè)門分析檢測、毛細管免疫分型電泳、毛細管血清蛋白電泳檢測的陽性率；（2）記錄流式細胞術(shù)與骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢測出的骨髓異常漿細胞的比例；（3）記錄流式細胞術(shù)對MM的分型結(jié)果及毛細管免疫分型電泳對MM的分型結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 比較各種檢查結(jié)果陽性率

（1）骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢查：骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢測陽性率為100%(56/56)，高于流式細胞術(shù)檢測陽性率96.43%（54/56），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（注：骨髓細胞形態(tài)學(xué)與流式細胞術(shù)對比：χ2=0.073，P=0.674）；高于毛細管免疫分型電泳檢測陽性率85.71%（48/56）及毛細管血清蛋白電泳檢測陽性率83.93%（47/56），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（注：骨髓細胞形態(tài)學(xué)與毛細管免疫分型電泳對比：χ2=5.653，P=0.015；骨髓細胞形態(tài)學(xué)與毛細管血清蛋白電泳對比：χ2=6.471，P=0.009）;（2）流式細胞術(shù)檢測：流式細胞術(shù)檢測陽性率為96.43%（54/56），陽性檢出率高于毛細管免疫分型電泳檢測陽性率85.71%（48/56）及毛細管血清蛋白電泳檢測陽性率83.93%（47/56），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（注：流式細胞術(shù)與毛細管免疫分型電泳對比：χ2=3.953，P=0.047；流式細胞術(shù)與毛細管血清蛋白電泳對比：χ2=4.940，P=0.026）；（3）毛細管免疫分型電泳與毛細管血清蛋白電泳檢查陽性率分別為85.71%（48/56）、83.93%（47/56），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（注：毛細管免疫分型電泳與毛細管血清蛋白電泳對比：χ2=0.069，P=0.792）。

表1 流式細胞術(shù)及毛細管免疫分型電泳對MM 的免疫球蛋白kappa 型輕鏈分型結(jié)果比較

表2 流式細胞術(shù)及毛細管免疫分型電泳對MM 的免疫球蛋白Labda 型輕鏈分型結(jié)果比較

2.2 比較流式細胞術(shù)與骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢出的異常漿細胞的比例

通過CD45/SSC聯(lián)合CD38/CD138設(shè)門分析，將CD45/SSC聯(lián)合CD38+/CD138+作為鑒別異常漿細胞的特異性指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)56例MM患者中54例在CD45/SSC散點圖可見異常細胞群，結(jié)合CD38/CD138鑒別為異常漿細胞，見圖1。通過流式細胞儀檢測到此54例陽性患者中的異常漿細胞比例為（33.59±8.41）%，低于同時期的骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢查的骨髓漿細胞比例（43.25±10.82）%，二者做線性相關(guān)統(tǒng)計分析，結(jié)果pearson相關(guān)系數(shù)r=0.82，tr=10.528，P＜0.05，表明二者呈線性正相關(guān)。

2.3 比較流式細胞術(shù)及毛細管免疫分型電泳對MM的分型結(jié)果

流式細胞學(xué)檢查56例MM患者中有54例MM的免疫球蛋白呈陽性表達，其中胞內(nèi)Kappa輕鏈單克隆21例（38.9%），胞內(nèi)labda輕鏈單克隆33例（61.1%）。毛細管免疫分型電泳檢查56例MM患者中48例MM分泌免疫球蛋白，其中表達Kappa輕鏈型的18例（37.5%），表達Labda輕鏈型的30例（62.5%），有3例流式細胞術(shù)胞內(nèi)Kappa輕鏈陽性而毛細管免疫分型電泳為陰性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（注：流式細胞術(shù)及毛細管免疫分型電泳對 MM的免疫球蛋白kappa型輕鏈分型結(jié)果比較：χ2=1.333，P=0.243），有3例流式細胞術(shù)胞內(nèi)labda輕鏈陽性而毛細管免疫分型電泳為陰性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（注：流式細胞術(shù)及毛細管免疫分型電泳對MM的免疫球蛋白labda型輕鏈分型結(jié)果比較：χ2=1.333，P=0.243），具體見表1、表2。

3 討論

MM可以歸到B淋巴細胞淋巴瘤的范圍，其臨床表現(xiàn)較復(fù)雜，且缺乏特異性，早期診斷時極易誤診或漏診，耽誤最佳治療時機[3-4]。骨髓涂片細胞形態(tài)學(xué)具有直觀、經(jīng)濟及操作簡單的特點，是最先用于MM患者診斷中[5]。MM細胞髓內(nèi)浸潤、增值范圍不同，經(jīng)過形態(tài)學(xué)檢查往往需要多次骨髓穿刺，有著較大差異性[6-7]。同時，在閱片選擇及細胞識別上，較強主觀性，與反應(yīng)性漿細胞增多相鑒別，從而增加誤診。毛細管血清蛋白電泳、毛細管免疫分型電泳可有效檢測骨髓瘤細胞產(chǎn)生并釋放入血的M蛋白，有較小創(chuàng)傷性，且具有快捷性及經(jīng)濟性[8-9]。流式細胞術(shù)免疫分型可快速準(zhǔn)確客觀鑒別出漿液細胞的良惡性，可客觀及評估惡性漿液細胞，并且能夠揭示骨髓瘤細胞免疫表型的異質(zhì)性及其胞內(nèi)輕鏈的克隆性。以上特點是毛細管血清蛋白電泳和毛細管免疫分型電泳技術(shù)無法達到的[10]。

圖1 流式細胞術(shù)CD45/SSC 聯(lián)合CD38/CD138 設(shè)門分析

流式細胞術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤中的應(yīng)用涉及以下幾方面：通過檢測漿細胞免疫表型、克隆性，可明確漿細胞是否是良性、惡性，還是反應(yīng)性的。流式細胞術(shù)可識別瘤細胞獨有的異常免疫常型，從復(fù)雜的骨髓細胞群中可圈出極其微量的瘤細胞；CD38、CD138為漿細胞特異性的表面標(biāo)志物，CD45在正常漿細胞弱表達而在骨髓瘤細胞表達減低或不表達，CD19在正常漿細胞表達而在骨髓瘤細胞弱表達或不表達，CD56在正常漿細胞不表達而在骨髓瘤細胞中表達增高，且被認為是疾病預(yù)后不良的標(biāo)志之一，cKappa輕鏈與clabda輕鏈在正常漿細胞呈多克隆表達，而在骨髓瘤細胞中為限制性表達[11]。同時可實現(xiàn)瘤細胞膜及胞內(nèi)分子檢測，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)輕鏈限制性表達，并不受到分泌與否及分泌多寡的影響。在本次研究中，通過流式細胞術(shù)對胞漿輕鏈限制性表達的一般特點給予抗體設(shè)置，其檢出率高于其他檢測方法。同時，本研究中有2例患者的流式細胞術(shù)結(jié)果為陰性，可能與多發(fā)性骨髓瘤的取材相關(guān)[3，12]。流式細胞術(shù)的應(yīng)用較為成熟，應(yīng)用于免疫分型具有較高的準(zhǔn)確性。

綜上所述，流式細胞術(shù)免疫分型對MM的診斷有較高價值，可作為診斷MM的有效手段。