高鴻偉，胡靜，楊蕊，周勝杰，于剛，馬振華,通信作者

（1.仲愷農業(yè)工程學院，廣州 510225；2.中國水產科學研究院 南海水產研究所 熱帶水產研究開發(fā)中心，海南 三亞572018；3.農業(yè)農村部 南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣州 510300；4.三亞熱帶水產研究所，海南 三亞 572018）

眼斑雙鋸魚（Amphiprion ocellaris）又稱公子小丑，外表酷似京劇中的丑角而得名，隸屬于雀鯛科、雙鋸魚屬，是熱帶海水觀賞魚中的一種，因其健壯易養(yǎng)、活潑可愛而深受廣大消費者喜愛，甚至供不應求，尤其是隨著電影《海底總動員》播出，眼斑雙鋸魚已成為炙手可熱的海水觀賞魚種。有關眼斑雙鋸魚的研究可追溯到上世紀50年代，為提高養(yǎng)殖效率以滿足市場需求，同時降低對野生捕撈的依賴兼顧環(huán)保，多年來，眾多學者對其展開了大量研究，包括發(fā)育學[1]、營養(yǎng)學[2]及病害學等方面，如Pirarat等[3]及Siva等[4]分別研究了眼斑雙鋸魚和?？p鋸魚的淋巴囊腫病的癥狀和組織生物學，但未見對其健康用藥的相關研究。本研究以眼斑雙鋸魚為研究對象，對其進行抗生素恩諾沙星濃度梯度浸泡試驗，并對其相關生理生化參數(shù)如酶活性及氧化產物含量進行測定分析，為今后更好地利用抗菌藥物提供一定理論依據。

恩諾沙星（Enrofloxacin）屬于氟喹諾酮類藥物（Ftuoroquinolones），又名乙基環(huán)丙沙星。其作用機理是與DNA回旋酶亞基A結合，從而抑制了酶的切割與連接功能，阻止了細菌DNA的復制，而呈現(xiàn)抗菌作用[5-7]。恩諾沙星被國家指定為動物專用藥，因其具有廣譜抗菌性及低殘留等優(yōu)勢而廣泛運用于動物疾病預防和治療[8-10]，由于其藥效顯著，在水產養(yǎng)殖如魚類養(yǎng)殖方面也漸漸得到廣泛應用[11-12]，所以在水產養(yǎng)殖上對于恩諾沙星用藥量就需要相關試驗探索。因而本試驗設置了0、5（說明書指定安全治療濃度）和10 mg/L 3種恩諾沙星劑量對眼斑雙鋸魚進行浸泡處理，探索其健康個體在恩諾沙星脅迫下生理生化的變化。應用分光光度法對眼斑雙鋸魚不同組織消化酶、免疫酶活性及氧化產物含量進行測定分析，分析安全治療濃度及高濃度處理下個體生理生化的差異，為眼斑雙鋸魚的健康治療用藥量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以眼斑雙鋸魚為試驗對象，魚苗由南海水產研究所熱帶水產研究開發(fā)中心陵水基地人工孵化而來，試驗于該基地原地進行。試驗前，苗種暫養(yǎng)于水族箱，充氣泵充氧，保證溶氧量≥6.5 mg /L，循環(huán)水連續(xù)供應換水，鹽度32±2，水溫（28±1）℃，pH 8.0～8.2，亞硝酸鹽含量小于0.03 mg/L，氨氮含量小于 0.01 mg/L。每天投喂兩次人工顆粒飼料，試驗前24 h停止喂食。

1.2 試驗設計

稱取恩諾沙星晶體，溶解于砂濾海水體積為20 L的儲物箱中，配置濃度分別為0、5和10 mg/L的海水溶液，并根據Fang[13]之前報道的HPLC方法確定水體中恩諾沙星的濃度。其中0 mg/L處理組為對照組，說明書所示安全治療濃度5 mg/L為中濃度處理組，10 mg/L為高濃度處理組，共計3組，每組3個平行。將90尾健康眼斑雙鋸魚幼魚個體（1.59±0.33）g隨機放入以上9個試驗容器中，每個容器10尾個體。試驗容器連續(xù)充氧，各水質參數(shù)與暫養(yǎng)時相同。以說明書指定最長治療時間24 h為試驗時間，期間停止喂食。試驗結束時，從每個試驗容器中隨機取3尾試驗個體，取樣時用6 mg/L丁香酚進行麻醉，用解剖刀剪取試驗個體的胃、腸及肝組織，其中胃、腸組織用于消化酶活性測定，肝臟組織用于免疫酶活性及氧化產物含量測定。所取組織用生理鹽水沖洗干凈并置于液氮罐中進行冷激，后保存于-80 ℃冰箱中備測。

1.3 樣品處理

各試驗組所取樣品稱重（單位:mg）后，于0.2 mol/L 生理鹽水中，按試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書指定比例分別進行研磨，研磨液2 ℃、15 000 r/min離心10 min，取上清，置于-80 ℃冰箱中備測。蛋白、氧化產物含量及各酶活性測定分別采用相關試劑盒進行（南京建成生物工程研究所）。

1.4 數(shù)據處理

數(shù)據采用Mean±SD表示，試驗數(shù)據通過SPSS 19.0 進行統(tǒng)計分析，先對數(shù)據作單因素方差分析（ANOVA），處理間若有顯著差異，再用Duncan 法進行多重比較，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 恩諾沙星浸泡對眼斑雙鋸魚幼魚免疫酶活性的影響

恩諾沙星對個體肝臟免疫酶活性的影響見圖1A～圖1G。試驗結果表明，恩諾沙星對眼斑雙鋸魚幼魚GSH、AKP、LZM、GST活性影響顯著（P＜0.05），恩諾沙星對眼斑雙鋸魚幼魚 SOD、CAT、POD活性影響不顯著（P＞0.05）。不同處理組間，GSH活性隨處理濃度升高呈先降低后升高現(xiàn)象；AKP活性隨處理濃度升高先升高后降低，但中、高濃度組不顯著（P＞0.05）；LZM、GST活性隨處理濃度升高呈上升趨勢，但LZM活性在5 mg/L分別與0、10 mg/L差異不顯著（P＞0.05），GST活性在0、5 mg/L差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 恩諾沙星對眼斑雙鋸魚幼魚免疫酶活性的影響

2.2 恩諾沙星浸泡對眼斑雙鋸魚幼魚消化酶活性的影響

恩諾沙星對個體腸道消化酶活性的影響見圖2A～圖2D。試驗結果表明，恩諾沙星對眼斑雙鋸魚幼魚胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶活性影響顯著（P＜0.05）。不同處理組間，個體胰蛋白酶、脂肪酶活性隨處理濃度升高呈先升高后降低現(xiàn)象，脂肪酶中、高濃度組差異不顯著（P＞0.05），而胃蛋白酶隨處理濃度的升高而降低。恩諾沙星對眼斑雙鋸魚幼魚淀粉酶活性影響不顯著（P＞0.05）。不同處理組間，個體淀粉酶活性均無顯著差異（P＞0.05）。個體淀粉酶活性大小隨處理濃度的增加呈遞減趨勢。

圖2 恩諾沙星對眼斑雙鋸魚幼魚消化酶活性的影響

2.3 恩諾沙星浸泡對眼斑雙鋸魚幼魚氧化產物含量的影響

恩諾沙星對個體肝臟LPO、MDA含量的影響見圖3A、圖3B。試驗結果表明，恩諾沙星對眼斑雙鋸魚幼魚LPO、MDA含量影響顯著（P＜0.05）。但不同處理組間，個體淀粉酶活性均存在顯著差異（P＜0.05），且個體LPO含量隨處理濃度的增加而呈遞增趨勢，MDA含量隨處理濃度增加呈遞增趨勢，且高濃度處理組個體MDA含量顯著高于其他組（P＜0.05），中濃度處理組與對照組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 恩諾沙星對眼斑雙鋸魚幼魚氧化產物含量的影響

3 討論

在試驗過程中，恩諾沙星浸泡對眼斑雙鋸魚3個處理組均無個體死亡現(xiàn)象，而機體免疫酶、消化酶及氧化產物含量在不同濃度恩諾沙星處理下存在差異，即不同參數(shù)受恩諾沙星處理影響程度不同。

3.1 恩諾沙星浸泡對眼斑雙鋸魚免疫酶活性影響

肝臟是水生動物如魚類的重要免疫器官，大量研究表明，眾多免疫反應主要發(fā)生在機體肝臟內[14]。免疫酶是動物免疫系統(tǒng)的重要組成部分[15]，主要包括抗氧化酶類和水解酶類，前者包括具抗氧化功能酶 GSH、SOD、CAT、POD等，能抑制和清除氧自由基，以保護機體免受氧化損傷；后者包括具排毒功能的酶類，如AKP、LZM和GST等[16]，能清除異物從而起到保護機體的作用[17]。各類酶功能不同，但又相互作用，共同完成一系列免疫反應，在不同環(huán)境脅迫下，不同酶活性變化不同[18]。

本試驗研究中，眼斑雙鋸魚GSH、GST活性對恩諾沙星較為敏感。GST是藥物代謝Ⅱ相反應中一類重要的藥物代謝轉移酶，可催化相當多的外來物，包括大多數(shù)藥物的代謝[19-20]，在10 mg/L濃度時，酶活性水平急劇增強，這可能是與 10 mg/L下GSH酶活水平的增強有關。陳琛等[21]研究表明，GSH作為生成GST的反應底物，二者可能同時對恩諾沙星起了應答作用，共同保護了肝組織。GSH活性隨著濃度增加出現(xiàn)先降低后升高的現(xiàn)象，推測在恩諾沙星藥物應激下，GSH結合GST功能起到了主要免疫功能，即在應對恩諾沙星應激的免疫反應中，排異反應起主導作用，抗氧化反應起次要作用，AKP及LZM的變化趨勢亦證明了該推斷。AKP是生物體內重要的解毒、排異體系[22]，個體肝臟AKP酶活性于安全治療濃度處理下，即出現(xiàn)顯著升高現(xiàn)象，證實5 mg/L時機體即受到脅迫且AKP活性升高以啟動解毒、排異功能，而10 mg/L處理下，其活性的降低暗示該濃度可能超出了肝組織的解毒能力，抑制了AKP活性，該現(xiàn)象與蔡深文等[23]研究乳酸諾氟沙星對草魚肝臟AKP影響結果一致。LZM作為水生生物生理防御水平的重要指標，是一種重要的非特異性免疫因子[24]，5 mg/L處理下，個體LZM活性雖然與對照組差異不顯著，僅在10 mg/L時差異顯著，但其活性與處理濃度呈正相關性，表明個體在藥物刺激作用下，LZM的免疫即排異機能已逐步啟動以對抗異物侵擾、保護機體免受損傷。張麗敏等[25]研究表明，高濃度恩諾沙星處理對紅笛鯛LZM活性影響較小，與本試驗的研究結果存在差異，因此高濃度對眼斑雙鋸魚幼魚LZM活性的影響規(guī)律還需進一步探索。不同酶對恩諾沙星所表現(xiàn)的應激有很大差異，顯示了不同酶的不同功能及先后反應機理，亦反映了不同酶間的免疫反應關聯(lián)，其內在機理有待進一步研究。本試驗中，不同酶應對恩諾沙星不同濃度處理的變化規(guī)律，顯示了即使在安全濃度處理下，機體酶活性即與對照組存在差異，甚至部分酶活性差異較顯著，因此在給眼斑雙鋸魚用藥時應注意用量控制。

3.2 恩諾沙星浸泡對眼斑雙鋸魚消化酶活性影響

胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶均是消化系統(tǒng)中重要的消化酶。消化酶活性是反映魚類消化生理機能的重要指標[26]。本試驗中，除淀粉酶所受影響較小（各濃度處理間酶活性差異均不顯著）外，其他3種酶受到恩諾沙星的影響較大。胃蛋白酶活性與恩諾沙星濃度呈顯著負相關，于5 mg/L處理下即顯著降低，說明中濃度恩諾沙星處理即已對眼斑雙鋸魚的胃組織產生不利影響，致使胃蛋白酶活性受抑制，從而抑制其蛋白消化功能。而胰蛋白酶、脂肪酶活性變化趨勢類似，于5 mg/L處理下即顯著高于對照組，且隨濃度升高呈下降趨勢。這可能是由于胰蛋白酶有限制酶原分解、活化的作用[27]，機體內通過分泌胰蛋白酶來抑制胃蛋白酶原的分解，所以胃蛋白酶隨恩諾沙星濃度升高而降低。脂肪酶活性的升高可能是由于機體需要更多能量來消除恩諾沙星對機體產生的影響，這與尹飛等[28]研究的低溫脅迫促使脂肪酶活性升高的結果相一致。而隨處理濃度的繼續(xù)升高，各消化酶活性均呈下降趨勢，結果表明高濃度恩諾沙星處理在一定程度上抑制了機體的消化性能，繼而對其攝食活性產生消極影響。基于恩諾沙星對眼斑雙鋸魚幼魚消化酶活性影響的研究結果表明，不同消化酶應對恩諾沙星應激的變化規(guī)律不一致，這可能與各消化酶主要功能及個體的食性相關，眼斑雙鋸魚為雜食偏肉食性魚類，進一步證實了在藥物應激下，個體胃蛋白酶活性反應最強烈，胰蛋白酶及脂肪酶次之，而淀粉酶最弱的結果。此外，部分消化酶如脂肪酶亦參與了抗氧化過程[29]，因此在某種程度上解釋了，恩諾沙星對眼斑雙鋸魚幼魚脂肪酶的影響程度較淀粉酶更強烈的現(xiàn)象。

3.3 恩諾沙星浸泡對眼斑雙鋸魚氧化產物含量的影響

氧化產物的含量反映了機體受毒害損傷的程度[30]。MDA含量反映膜質氧化的程度[31]，同時也是LPO鏈式反應的最終產物[32]。在Suna等[33]對大鼠口服硫丹的研究中，6周后個體心臟MDA含量升高。在 Atif等[34]對翠鱧的研究中，個體硫丹暴露24 h后，個體各組織LPO含量升高。本試驗中，眼斑雙鋸魚幼魚肝臟MDA及LPO含量隨恩諾沙星濃度的升高呈升高趨勢，二者均在10 mg/L處理下活性最大，不同的是MDA含量于10 mg/L處理下與對照組差異顯著，而LPO在5 mg/L即顯著高于對照組。結果表明，個體在恩諾沙星浸泡應激下，肝臟積累了大量氧化產物，尤其是高濃度處理下氧化產物含量更高，結果表明此時抗氧化系統(tǒng)正在運作。至于機體所能承受的最大氧化產物（如 MDA、LPO）含量有待進一步研究，相關研究結果有助于判定在該試驗所設定處理濃度下，個體機體肝臟是否受到損傷及損傷程度。

4 結論

恩諾沙星作為最具代表的有效抗生素藥物而廣泛應用于水產養(yǎng)殖，但其在使用時需針對不同的物種探索最適藥用量才能達到最佳治療效果，在消除病害的同時，把對個體組織的損傷控制在最小程度。本試驗中，根據個體免疫酶、消化酶活性及氧化產物對恩諾沙星的應激反應綜合分析得出，就眼斑雙鋸魚幼魚而言，最佳藥用量應控制在5 mg/L以內，具體最適藥用量還需進一步探索。