賀祥素，柴慈江，郭靜，朱霖，王雪彤，馮濤

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津300384）

櫻桃李（Prunus cerasiferaEhrh.）為薔薇科李屬植物，俗稱野酸梅，主要分布于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁地區(qū)的野果林內(nèi)[1]。櫻桃李是一種珍貴的野生果樹(shù)資源，也是中國(guó)稀有瀕危樹(shù)種之一，被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)物種[2]。

櫻桃李營(yíng)養(yǎng)全面且價(jià)值較高[3]，某些營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)甚至高于藍(lán)莓[4]，還有醫(yī)療保健價(jià)值[5-8]。櫻桃李花朵美麗，果色鮮艷，還可作為觀賞樹(shù)種在城市綠化中利用[9]。大量培育櫻桃李優(yōu)質(zhì)苗木對(duì)櫻桃李資源保護(hù)及其優(yōu)良單株的引種推廣具有重要意義。采用植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)將是快速獲得櫻桃李大量?jī)?yōu)質(zhì)苗木的有效途徑[10]。目前，關(guān)于櫻桃李組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的研究國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)少數(shù)報(bào)道。劉崇琪等對(duì)櫻桃李莖段腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)、增殖及葉片培養(yǎng)再生植株進(jìn)行了研究[11]，李海臣等不僅研究了櫻桃李莖段腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)及增殖外，還對(duì)櫻桃李試管苗的生根培養(yǎng)進(jìn)行了探討[12]，浦艷吉研究了影響櫻桃李莖尖培養(yǎng)的因素[13]，侍藝等對(duì)櫻桃李莖段外植體的滅菌培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了探討[14]。從目前研究狀況看，櫻桃李組培快繁技術(shù)距離生產(chǎn)應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路。本研究對(duì)櫻桃李莖段外植體滅菌、試管苗增殖、生根及移栽各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了初步探討，以便為完善櫻桃李組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為種植在天津農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)園內(nèi)的櫻桃李（Prunus cerasiferaEhrh.）6年生實(shí)生苗，已開(kāi)花結(jié)果。該實(shí)生苗引自新疆。生根培養(yǎng)用土為取自東校區(qū)地被植物園的黏壤土，6月份取土后裝入塑料花盆，放置在露天地表，經(jīng)一個(gè)雨季的雨水淋洗后，風(fēng)干，過(guò)1 mm篩后備用。從花卉市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)細(xì)粒蛭石，同樣過(guò)1 mm篩備用。

1.1 櫻桃李新梢莖段滅菌中不同取材時(shí)期及酒精浸泡后處理方式的研究

不同取材時(shí)期的研究:分別于2018年5月15日和7月9日采集櫻桃李當(dāng)年生新梢莖段，去掉葉片后剪成帶有2個(gè)側(cè)芽的莖段，用洗衣粉清洗后用自來(lái)水洗凈，晾干表面水分后在 70%酒精中浸泡約 10 s，然后用無(wú)菌水清洗一次，濾紙吸干表面水分后在2%次氯酸鈉溶液中浸泡25 min，無(wú)菌水清洗4次，然后將莖段接種于培養(yǎng)基中。

酒精浸泡后處理方式的研究:7月9日采集的莖段另做一個(gè)酒精浸泡后不同的處理，即用 70%酒精浸泡10 s后，不經(jīng)無(wú)菌水清洗，直接放入2%次氯酸鈉溶液中浸泡25 min，無(wú)菌水清洗4次，然后將莖段接種于培養(yǎng)基中，與上述7月9日取材并在酒精浸泡后用無(wú)菌水清洗的進(jìn)行比較。

上述 2項(xiàng)試驗(yàn)接種用培養(yǎng)基均為添加 6-BA 0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基。接種后在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為23～28 ℃，光照1 500～3 000 lx，光照時(shí)間為14 h/d。培養(yǎng)2周后調(diào)查接種莖段的污染率及萌芽狀況。

1.2 櫻桃李試管苗增殖培養(yǎng)中適宜IBA濃度篩選

在1/2MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的IBA，IBA濃度設(shè)計(jì)為6個(gè)處理:0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L，各種培養(yǎng)基中均添加15 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH調(diào)整至5.9，分裝于100 mL三角瓶中，121℃下滅菌20 min。每瓶接種4根長(zhǎng)約1 cm的櫻桃李試管苗莖段，每處理接種7瓶共28個(gè)莖段。接種后在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同試驗(yàn)1.1。培養(yǎng)20 d時(shí)調(diào)查試管苗生根率，60 d后調(diào)查試管苗莖長(zhǎng)及繁殖系數(shù)。培養(yǎng)期間每隔20 d調(diào)查一次試管苗新生莖長(zhǎng)，以便了解莖生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。

1.3 櫻桃李試管苗土壤支撐生根培養(yǎng)試驗(yàn)

本項(xiàng)試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理:

黏壤土支撐培養(yǎng):以方形PC瓶為培養(yǎng)瓶，將上述黏壤土與蛭石按照1∶2的體積比混和后加入培養(yǎng)瓶，每瓶加入100 mL。然后每瓶加入60 mL 培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的成分為含有0.3 ml/L IBA和15 g/L蔗糖的蒸餾水，pH 6.5。培養(yǎng)基配制完成后在121 ℃下滅菌20 min，然后在超凈工作臺(tái)中接種櫻桃李試管苗莖段，每瓶接入8根長(zhǎng)約1 cm的櫻桃李試管苗莖段，共接種4瓶32個(gè)莖段。

瓊脂支撐培養(yǎng)（對(duì)照）:以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加0.3 mg/L的IBA和15 g/L的蔗糖，以7 g/L瓊脂做固化劑，pH為5.9，以100 mL三角瓶為培養(yǎng)容器，每瓶裝入培養(yǎng)基約40 mL，培養(yǎng)基配制完成后在121 ℃下滅菌20 min，然后在超凈工作臺(tái)中接種櫻桃李試管苗莖段，每瓶接入4根長(zhǎng)約1 cm的櫻桃李試管苗莖段，共接種8瓶32個(gè)莖段。

上述兩處理接種后在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同試驗(yàn)1.1。培養(yǎng)40 d后調(diào)查試管苗的生根率、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、葉數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)。同時(shí)在顯微鏡下觀察根毛發(fā)生狀況并拍照。

1.4 櫻桃李試管苗移栽試驗(yàn)

將試驗(yàn) 1.3中黏壤土支撐培養(yǎng)和瓊脂支撐培養(yǎng)中生根的櫻桃李試管苗，在進(jìn)行根系長(zhǎng)度的測(cè)定后裸根移栽入黏壤土與蛭石體積比為1∶1的移栽基質(zhì)中，移栽后用塑料薄膜覆蓋保濕并放于向陽(yáng)的室內(nèi)，室內(nèi)溫度為20～30 ℃，移栽3周后調(diào)查試管苗成活率。

上述各項(xiàng)試驗(yàn)中，對(duì)調(diào)查的各項(xiàng)百分率指標(biāo)用卡平方測(cè)驗(yàn)獨(dú)立性，其他各項(xiàng)指標(biāo)均按照完全隨機(jī)試驗(yàn)單向分組資料的統(tǒng)計(jì)分析方法做方差分析，并用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時(shí)期對(duì)櫻桃李新梢莖段滅菌培養(yǎng)效果的影響

由表1可見(jiàn)，5月15日和7月9日兩個(gè)時(shí)期采集的櫻桃李新梢莖段，用酒精和次氯酸鈉滅菌后的污染率無(wú)顯著差異，均低于10%。莖段的褐化率和萌芽率也無(wú)顯著差異，褐化率低于5%，萌芽率為100%。上述結(jié)果表明，5月中旬和7月上旬兩個(gè)采集時(shí)期對(duì)滅菌效果無(wú)明顯影響。這兩個(gè)時(shí)期采集櫻桃李新梢莖段，用酒精和次氯酸鈉滅菌均可 達(dá)到理想的滅菌效果。

表1 取材時(shí)期對(duì)櫻桃李新梢莖段滅菌效果的影響

2.2 酒精浸泡后處理方式對(duì)櫻桃李新梢莖段滅菌效果的影響

由表2可見(jiàn)，無(wú)菌水洗與不水洗兩個(gè)處理莖段的污染率、褐化率與萌芽率等指標(biāo)均無(wú)顯著差異，污染率均低于10%、褐化率均低于5%，而萌芽率均為100%。上述結(jié)果表明，對(duì)于櫻桃李新梢莖段，在用酒精（70%）浸泡后與用次氯酸鈉（2%）浸泡前，用無(wú)菌水沖洗與否對(duì)滅菌效果無(wú)明顯影響。因此，為了簡(jiǎn)化滅菌程序，在用酒精和次氯酸鈉對(duì)櫻桃李新梢莖段滅菌時(shí)，酒精浸泡后可以不用無(wú)菌水沖洗莖段，直接將莖段放入次氯酸鈉中浸泡滅菌。圖1為酒精浸泡后兩種方式處理的櫻桃李莖段滅菌培養(yǎng)狀況。

表2 酒精浸泡后處理方式對(duì)櫻桃李新梢莖段滅菌效果的影響

圖1 酒精浸泡后處理方式對(duì)櫻桃李莖段滅菌培養(yǎng)效果的影響

2.3 IBA濃度對(duì)櫻桃李試管苗增殖的影響

由表3可見(jiàn)，不同濃度IBA各處理之間的莖長(zhǎng)存在顯著性差異，但是表現(xiàn)并不規(guī)律。IBA濃度為0.3 mg/L處理的莖長(zhǎng)顯著高于0.1 mg/L和0.2 mg/L兩個(gè)濃度處理，但與對(duì)照無(wú)顯著差異。IBA濃度為0.4 mg/L和0.5 mg/L兩個(gè)處理的莖長(zhǎng)與0.3 mg/L處理無(wú)顯著差異，但均顯著高于其他3個(gè)處理。各處理繁殖系數(shù)也存在顯著差異，其變化規(guī)律與莖長(zhǎng)相似。IBA濃度為0.3、0.4和0.5 mg/L 3個(gè)處理的繁殖系數(shù)差異不顯著。0.4 mg/L的處理顯著高于對(duì)照及0.1、0.2 mg/L兩個(gè)處理。綜合上述結(jié)果，以IBA濃度為0.4 mg/L的處理為最佳處理，形成的莖長(zhǎng)最長(zhǎng)，繁殖系數(shù)最高為4.2。由于本試驗(yàn)培養(yǎng)周期為60 d，按照4.2的繁殖系數(shù)，接種1個(gè)莖段一年內(nèi)僅可獲得約5 500個(gè)莖段，繁殖速度還不是很快。因此，繁殖系數(shù)還有必要進(jìn)一步提高。

表3 不同IBA濃度對(duì)櫻桃李試管苗增殖的影響

試驗(yàn)觀察到，接種后20 d時(shí)各處理莖生長(zhǎng)均不明顯，接種后20～60 d莖的生長(zhǎng)有逐漸加快的趨勢(shì)（圖2）。

圖2 櫻桃李試管苗莖段接種后萌生新莖的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

另外，試驗(yàn)中觀察到，接種后培養(yǎng)20 d時(shí)，各處理生根率基本達(dá)到最大，但此時(shí)莖段基本沒(méi)有萌芽生長(zhǎng)。各處理均是先發(fā)根，后萌芽生長(zhǎng)。沒(méi)有生根的莖段也沒(méi)有萌芽，個(gè)別莖段甚至最后枯死。由此看來(lái)，新生莖的生長(zhǎng)與生根關(guān)系密切，為促進(jìn)繁殖系數(shù)的提高，關(guān)鍵在于提高生根率。從本試驗(yàn)各處理生根率來(lái)看，除對(duì)照外均在 50%左右（表3），因此生根率還有很大的提高空間。從表3還可以看到，雖然IBA濃度為0.3、0.4 mg/L時(shí)的生根率較高，但與其他各處理及對(duì)照均無(wú)明顯差異，說(shuō)明本試驗(yàn)中添加IBA對(duì)櫻桃李莖段的根系發(fā)生沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。如何提高櫻桃李莖段的生根率尚待進(jìn)一步研究。

綜合上述分析，IBA濃度為0.4 mg/L的處理為本試驗(yàn)最佳處理，繁殖系數(shù)最高，可達(dá)4.2。繁殖系數(shù)的進(jìn)一步提高將依賴于生根率的提高。

本試驗(yàn)中各處理所形成的試管苗生長(zhǎng)健壯，莖粗葉大，將對(duì)后期的生根培養(yǎng)十分有利（圖3）。

2.4 櫻桃李試管苗土壤支撐生根培養(yǎng)效果

由表4可見(jiàn)，以黏壤土做培養(yǎng)基支撐物的處理的生根率為 68.8%，顯著高于瓊脂做培養(yǎng)基支撐物的處理，根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)及葉數(shù)與瓊脂支撐培養(yǎng)的無(wú)顯著差異，兩個(gè)處理的萌芽率無(wú)顯著差異。上述結(jié)果表明，與瓊脂支撐生根培養(yǎng)對(duì)照相比，黏壤土做培養(yǎng)基支撐物可以明顯促進(jìn)櫻桃李試管苗根系的發(fā)生（圖4）。

表4 土壤做培養(yǎng)基支撐物對(duì)櫻桃李試管苗生根培養(yǎng)的影響

圖4 兩種培養(yǎng)基中櫻桃李試管苗的生根狀況

通過(guò)顯微鏡對(duì)根表面的觀察，黏壤土支撐培養(yǎng)的櫻桃李試管苗的根表面生有大量根毛，而瓊脂支撐培養(yǎng)的根表面基本無(wú)根毛的發(fā)生（圖5）。

圖5 兩種培養(yǎng)基中櫻桃李試管苗的根毛發(fā)生狀況

綜合上述分析，與瓊脂支撐培養(yǎng)對(duì)照相比，以黏壤土做培養(yǎng)基支撐物進(jìn)行櫻桃李試管苗的生根培養(yǎng)，可以明顯提高生根率，而且根表面生有根毛，同時(shí)可以降低成本，因此黏壤土做培養(yǎng)基支撐物是櫻桃李試管苗生根培養(yǎng)的較佳處理。

2.5 櫻桃李試管苗移栽效果

由表5可見(jiàn)，黏壤土支撐培養(yǎng)中獲得的櫻桃李試管苗的移栽成活率為 75%，顯著高于瓊脂支撐培養(yǎng)中獲得的試管苗。分析其原因，一方面可能是黏壤土支撐物中生根的試管苗對(duì)移栽后的土壤基質(zhì)適應(yīng)性較強(qiáng)的緣故。另一方面，黏壤土中生根的試管苗生有大量根毛，增強(qiáng)了根系的吸收能力，因此有利于成活率的提高。對(duì)此尚待進(jìn)一步研究。

表5 櫻桃李試管苗移栽效果

3 討論與結(jié)論

外植體滅菌接種以獲得無(wú)菌莖芽是植物離體快速繁殖的首要環(huán)節(jié)。酒精（70%）是外植體常用的滅菌劑之一。酒精除了自身具有殺菌作用外，還可以濕潤(rùn)外植體表面，排除外植體表面的空氣，利于其他滅菌劑的滲入[15]。因此，在使用其他滅菌劑浸泡滅菌之前，一般先用酒精浸泡一定時(shí)間。而且在酒精浸泡后，通常要用無(wú)菌水沖洗后再放入其他滅菌劑中浸泡[16-19]。但有一些研究中用酒精浸泡后沒(méi)有用無(wú)菌水沖洗[20-21]。本項(xiàng)結(jié)果中酒精浸泡后使用無(wú)菌水沖洗與否對(duì)櫻桃李莖段的滅菌效果無(wú)明顯影響，因此可以在酒精浸泡后免去無(wú)菌水沖洗環(huán)節(jié)，使櫻桃李莖段滅菌過(guò)程得以簡(jiǎn)化。

侍藝等研究表明，使用次氯酸鈉做主要滅菌劑對(duì)櫻桃李水培枝萌發(fā)嫩莖和5月下旬采集的新梢莖段有很好的滅菌效果[14]。本項(xiàng)研究中，對(duì) 7月上旬采集的櫻桃李新梢莖段用次氯酸鈉滅菌效果與5月份采集的無(wú)顯著差異，而且污染率均低于10%，萌芽率達(dá)到100%，再次證明以次氯酸鈉做主要滅菌劑可以獲得令人滿意的結(jié)果。同時(shí)也表明櫻桃李新梢莖段外植體的取材適期可以由 5月份延長(zhǎng)至7月上旬。

木本植物試管苗增殖的主要方式是促進(jìn)腋芽發(fā)枝和單芽莖段扦插[10]。目前的研究中櫻桃李試管苗的增殖多采用促進(jìn)腋芽發(fā)枝的方式。但是這種方式形成的叢生芽缺乏明顯的加長(zhǎng)生長(zhǎng)，會(huì)對(duì)后期的生根培養(yǎng)造成一定影響。浦艷吉等在培養(yǎng)基中加入0.03 mg/L GA3對(duì)叢生芽的伸長(zhǎng)起到了一定的促進(jìn)作用[13]。單節(jié)莖段扦插增殖方式一般形成一個(gè)單軸延伸的莖，增殖與生根同時(shí)進(jìn)行，形成的試管苗也較健壯。在葡萄、棗等多種木本植物試管苗增殖中常用單節(jié)莖段扦插的方式[22-23]。本項(xiàng)研究表明，在含有IBA 0～0.5 mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中櫻桃李試管苗均可以形成單軸延伸的莖，而且試管苗莖粗葉大，個(gè)別莖長(zhǎng)可達(dá)10 cm，平均莖長(zhǎng)則以IBA濃度為0.4 mg/L的處理最長(zhǎng)，繁殖系數(shù)也以該處理最高，達(dá)到4.2。盡管這一繁殖系數(shù)不是很高，但是試管苗生長(zhǎng)健壯，有利于后續(xù)的生根培養(yǎng)。因此，此種增殖方式在進(jìn)一步提高繁殖系數(shù)后有望成為櫻桃李試管苗較好的增殖方式。

櫻桃李試管苗的生根培養(yǎng)目前都是在瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行的[11-13]。以土壤做培養(yǎng)基支撐物進(jìn)行試管苗的生根培養(yǎng)，可以明顯降低試管苗成本，提高生根質(zhì)量，而且有利于移栽成活，已經(jīng)在珠美海棠、栒 子等多個(gè)樹(shù)種上試驗(yàn)成功[24-25]。以土做培養(yǎng)基支撐物還可以將試管苗的生根培養(yǎng)放在溫室中[26-28]甚至露地環(huán)境中進(jìn)行[29-30]，從而進(jìn)一步降低成本。本項(xiàng)結(jié)果以黏壤土做培養(yǎng)基支撐物進(jìn)行櫻桃李試管苗生根培養(yǎng)，生根率顯著高于瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)的試管苗，試管苗生有根毛，移栽成活率也顯著高于瓊脂培養(yǎng)基中的試管苗，這與柴慈江等人的研究結(jié)果基本一致[24-25]。

因此，本項(xiàng)研究初步得出以下結(jié)論:2018年5月15日和7月9日取櫻桃李新梢莖段，用70%酒精和2%次氯酸鈉滅菌，取材時(shí)期對(duì)滅菌培養(yǎng)效果無(wú)明顯影響，這兩個(gè)時(shí)期取材污染率均低于10%、萌芽率均達(dá)100%；酒精浸泡后用無(wú)菌水沖洗與否對(duì)滅菌效果無(wú)明顯影響；在含有0.4 mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d櫻桃李試管苗繁殖系數(shù)為4.2；在黏壤土做支撐物的培養(yǎng)基上櫻桃李試管苗的生根率為 68.8%，顯著高于瓊脂培養(yǎng)基；土壤支撐培養(yǎng)的櫻桃李試管苗的移栽成活率為75%，顯著高于瓊脂支撐培養(yǎng)的試管苗（33.3%）。