洪春桃，沈登鋒，魏斌，章建紅

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，浙江 寧波 315040)

三葉青(Tetrastigmahemsleyanum)，中文學(xué)名為三葉崖爬藤，又名蛇附子、石抱子、金線吊葫蘆、三葉對(duì)、小扁藤、三葉扁藤、攔山虎、雷膽子等，藥名為三葉青，是葡萄科崖爬藤屬多年生蔓生藤本植物，為中國特有珍稀中藥植物[1-2]。臨床上已逐步用于肝癌、肺癌、白血病與艾滋病等疾病的治療，被稱為安全無毒的“植物青霉素”[3]。由于人為過度采挖，三葉青野生資源銳減，已處于瀕危狀態(tài)[1, 4]，因此，開展三葉青的組織快繁技術(shù)研究十分重要。許多研究人員進(jìn)行了一定的初步研究，但是目前已報(bào)道的三葉青組織快繁體系中外植體選擇、滅菌方式、培養(yǎng)基配方和預(yù)期效果等都各不相同，給種植戶和研究人員在選擇三葉青組織培養(yǎng)方法時(shí)帶來較多不便。筆者通過文獻(xiàn)檢索篩選得到11種不同的三葉青的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，從外植體選擇、滅菌、腋芽誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽增殖和不定根誘導(dǎo)等方面對(duì)這11種體系進(jìn)行評(píng)價(jià)和優(yōu)化，以期建立一種最佳的三葉青組織快繁的技術(shù)體系，為今后三葉青組織培養(yǎng)的快速繁殖體系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)材料為寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院在鄞州區(qū)橫溪鎮(zhèn)大岙村栽培的三葉青種苗，2017年5月采集嫩葉和腋芽莖段帶回實(shí)驗(yàn)室組培室進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)。組培室培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光周期為12 h∶12 h(光/暗)，光照強(qiáng)度為4 000 lx。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌

綜合歸納不同文獻(xiàn)的試驗(yàn)方法，篩選出3種外植體滅菌方式進(jìn)行三葉青外植體的滅菌試驗(yàn)，每組處理具體方法如下：處理1，選擇剪成塊狀的葉片與1～2 cm帶腋芽莖段作為外植體，流水沖洗3～4 h，75%乙醇浸泡1 min，含2～3滴吐溫20的0.1% HgCl215 min(40～50 r·min-1搖床振蕩消毒)，MS培養(yǎng)基中加入1 mg·L-1氨芐、0.3 g·L-1真菌抑菌劑[5]；處理2，選擇剪成塊狀的葉片與1～2 cm帶腋芽莖段作為外植體，流水沖洗30～60 min，70%乙醇浸泡1 min，含2～3滴吐溫20的0.1% HgCl2浸泡15 min，期間輕搖晃，無菌水清洗5次，無菌濾紙吸干水分，切去處理后莖段的兩端[6]；處理3，選擇剪成塊狀的葉片與1～2 cm帶腋芽莖段作為外植體，再用5%洗衣粉水溶液漂洗5 min，再用自來水沖洗30 min，75%乙醇擦洗表面，0.1% HgCl2消毒5 min，2%次氯酸鈉消毒20 min，無菌水沖洗4～6次，再將莖段切成0.5～1.0 cm的小段，葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的塊狀[7]。每個(gè)處理葉片設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20片，共100片。每個(gè)處理莖段設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)，共30個(gè)帶腋芽莖段，接種7 d后統(tǒng)計(jì)污染情況。

1.2.2 腋芽誘導(dǎo)

篩選5種文獻(xiàn)報(bào)道的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，采用滅菌腋芽莖段進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)試驗(yàn)，具體培養(yǎng)基配方如下：S1，WPM+0.8 mg·L-16-BA[5]；S2，1/2MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA[6]；S3，1/2MS+0.5 mg·L-16-BA[8]；S4，MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA[7]；S5，1/2MS+0.8 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1氨芐+0.3 mg·L-1真菌抑菌劑+25%活性炭(筆者自配培養(yǎng)基)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種5個(gè)帶腋芽莖段，接種28 d后觀察并統(tǒng)計(jì)腋芽生長情況。

1.2.3 不定芽增殖

篩選4種文獻(xiàn)報(bào)道的不定芽增殖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，并對(duì)其進(jìn)行不同組別試驗(yàn)，具體培養(yǎng)基配方如下：C1，MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA[9]；C2，MS+3.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA+2 g·L-1蛋白胨[10]；C3，2/3MS+2.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA[11]；C4，MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA[12]。以誘導(dǎo)得到的腋芽作為材料，接種到不定芽增殖培養(yǎng)基上，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少接種3個(gè)，接種70 d后觀察不定芽的愈傷生長與增殖情況。

1.2.4 不定根誘導(dǎo)試驗(yàn)

將獲得的不定芽在節(jié)間處切下，進(jìn)行不定根誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。篩選6種文獻(xiàn)報(bào)道的不定根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，具體配方如下：R1，WPM+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1IBA[5]；R2，1/2MS+0.5 mg·L-1IBA[6]；R3，MS+1.0 mg·L-1NAA[13]；R4，1/2MS+1.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA[7]；R5，MS+0.5 mg·L-1IBA[14]；R6，1/2MS+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA[11]。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種5個(gè)腋芽，接種14 d后觀察并統(tǒng)計(jì)不定根生長情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 18.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

用3種不同外植體滅菌方式對(duì)三葉青含腋芽莖段與葉片進(jìn)行處理，7 d后統(tǒng)計(jì)污染情況。由表1可知，處理2中2種外植體滅菌后效果較佳，未污染率達(dá)到97%；其次是處理1，葉片未污染率為92%，腋芽莖段為83%；處理3的滅菌效果較差，對(duì)2種外植體的滅菌效果均未達(dá)到50%。由此可見，以含腋芽莖段與葉片為外植體時(shí)，在0.1% HgCl2中添加適量表面活性劑吐溫20有助于增強(qiáng)滅菌效果。該方法也廣泛應(yīng)用于其他藥用植物外植體的滅菌，如廣豆根[15]、金線蓮[16]等。

表1 滅菌方式對(duì)三葉青外植體的影響

2.2 腋芽誘導(dǎo)

用5種不同培養(yǎng)基配方進(jìn)行腋芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果顯示，S3培養(yǎng)基腋芽成活率最高，為96.7%；其次為S4、S1和S2培養(yǎng)基，其腋芽成活率分別為86.7%、83.3%和76.7%，S5培養(yǎng)基成活率最低(表2)。培養(yǎng)16 d后，S1～S4培養(yǎng)基出現(xiàn)不同程度的褐化，在S4培養(yǎng)基培養(yǎng)28 d后腋芽基部有愈傷組織生成(圖1)。S5培養(yǎng)基腋芽的成活率低，可能與添加的氨芐霉素和真菌抑制劑有關(guān)。此外，S5培養(yǎng)基可以抑制后期腋芽的褐化，說明加入活性炭對(duì)防褐化具有明顯的效果。綜上，采用S1，S2和S4培養(yǎng)基獲得的腋芽成活率基本與參考的文獻(xiàn)結(jié)果一致，但這些文獻(xiàn)沒有涉及褐化問題[5, 6, 17]。錢麗華[8]的研究沒有明確測(cè)定S3培養(yǎng)基中三葉青腋芽的成活率，本研究發(fā)現(xiàn)其成活率顯著都高于其他培養(yǎng)基，因此，建議采用1/2MS+0.5 mg·L-16-BA+25%活性炭進(jìn)行腋芽的誘導(dǎo)。

表2 5種培養(yǎng)基配方培養(yǎng)16 d后三葉青腋芽的誘導(dǎo)情況

圖1 S3培養(yǎng)基和S4培養(yǎng)基上的腋芽

2.3 不定芽誘導(dǎo)增殖

用4種不同培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C1培養(yǎng)基的愈傷組織生長形態(tài)較好，多表現(xiàn)為深綠色，結(jié)構(gòu)比較致密，其腋芽的出愈率為100%，易分化產(chǎn)生不定芽，且不定芽的增殖倍數(shù)為3.1(表3，圖2)。其次為C4培養(yǎng)基，腋芽的出愈率為93.3%，愈傷組織形態(tài)為淺綠色，結(jié)構(gòu)致密，但不定芽誘導(dǎo)效果較C1培養(yǎng)基差。C2和C3培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織及其分化能力均較差，結(jié)構(gòu)較為疏松，不定芽長勢(shì)弱(表3)。表明高濃度的6-BA和低濃度的NAA有助于三葉青愈傷組織的誘導(dǎo)，該結(jié)果與大多數(shù)報(bào)道一致[8, 9,17]。因此，建議采用MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA作為三葉青不定芽誘導(dǎo)增殖的較佳培養(yǎng)基。

表3 4種培養(yǎng)基培養(yǎng)70 d后不定芽的增殖情況

圖2 4種培養(yǎng)基培養(yǎng)70 d后不定芽的誘導(dǎo)增殖情況

2.4 不定根誘導(dǎo)

用6種不同培養(yǎng)基配方進(jìn)行三葉青不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果如表4和圖3所示。R2培養(yǎng)基誘導(dǎo)的不定根最多，平均為8.6個(gè)，平均根長為6.6 cm，有新葉長出，且長勢(shì)茂盛，為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基(圖3中B)。R1、R3、R4均含有1.0 mg·L-1的NAA，誘導(dǎo)出的不定根有大量的根毛，R1培養(yǎng)基盡管有新葉長出，但長勢(shì)一般，R3和R4培養(yǎng)基誘導(dǎo)的根數(shù)較少，生長也較為緩慢，且根部有愈傷組織長出，不適合做不定根的誘導(dǎo)。 R6培養(yǎng)基包含1.0 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA，嚴(yán)重限制了不定根的誘導(dǎo)和腋芽的生長，不建議使用該培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定根(圖3中F)。以上培養(yǎng)基與前人研究結(jié)果有一定的差異，我們推測(cè)可能跟培養(yǎng)條件和藥品純度有關(guān)。R5培養(yǎng)基誘導(dǎo)的平均根個(gè)數(shù)為5.1個(gè)，根長達(dá)到7.8 cm，也有新葉長出，長勢(shì)也比較茂盛(圖3中E)，其與R2培養(yǎng)基的區(qū)別在于采用MS為主培養(yǎng)基，而R2培養(yǎng)基采用1/2MS為主培養(yǎng)基，考慮到成本問題，建議采用R2培養(yǎng)基用于不定根的誘導(dǎo)。因此，最佳的三葉青不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg·L-1IBA。

表4 三葉青不定根的誘導(dǎo)結(jié)果

圖3 誘導(dǎo)不定根的形成

3 小結(jié)

該研究的試驗(yàn)結(jié)果大部分與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但是也有部分?jǐn)?shù)據(jù)無法重復(fù)文獻(xiàn)中的結(jié)果，這可能跟外植體選擇、實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件、操作人員的操作技巧，以及藥品純度都有直接的關(guān)系。經(jīng)過比較試驗(yàn)，優(yōu)化出一套三葉青高效組織快繁的技術(shù)體系：采用腋芽莖段為外植體，用75%乙醇消毒1 min，含3滴吐溫20的0.1% HgCl2滅菌15 min，接種于1/2MS+0.5 mg·L-16-BA+25%活性炭培養(yǎng)基誘導(dǎo)腋芽，21 d后接種于MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽增殖誘導(dǎo)，最后采用1/2MS+0.5 mg·L-1IBA培養(yǎng)基誘導(dǎo)，14 d后形成不定根。該研究可為研究人員進(jìn)行三葉青組織快繁試驗(yàn)提供一定的科學(xué)依據(jù)，有助于縮短試驗(yàn)周期，節(jié)約成本。