王占娣，李 嫻，孫 龍，丁偉峰，馮 穎

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明650233;2.玉溪師范學(xué)院，云南 玉溪653100)

雄激素性脫發(fā)又稱脂溢性脫發(fā)，是臨床最常見(jiàn)的脫發(fā)類型，其致病機(jī)制有多種假說(shuō)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其與雄激素的異常表達(dá)及其代謝過(guò)程有關(guān)[1]，5α-還原酶的活性及其催化生成的二氫睪酮是導(dǎo)致毛發(fā)脫落的主要原因[2-3]。目前，針對(duì)脂溢性脫發(fā)致病機(jī)制開(kāi)發(fā)的藥物有雄激素受體抑制劑、促性腺激素釋放激素(GnRH)受體拮抗劑和5α-還原酶抑制劑3類。這些藥物主要作用于雄激素受體或5α-還原酶，調(diào)節(jié)紊亂的激素水平。白蠟是由白蠟蟲(chóng)半翅目蚧總科白蠟蚧屬雄性幼蟲(chóng)分泌的次生代謝物質(zhì)漂洗加工而成[4]，《集玄方》記載：“頭上禿瘡，蠟燭頻涂，勿令日曬，久則自然生發(fā)?！闭f(shuō)明白蠟治療脫發(fā)有一定作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，白蠟?zāi)艽龠M(jìn)脂溢性脫發(fā)模型小鼠毛發(fā)的生長(zhǎng)，但對(duì)其治療脂溢性脫發(fā)的機(jī)制尚不明確。因此，本文以KM小鼠和人真皮乳頭細(xì)胞(HFDPC)為模型生物，探討白蠟對(duì)脂溢性脫發(fā)模型小鼠體內(nèi)激素水平、5α-還原酶活性和二氫睪酮誘導(dǎo)的HFDPC生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用，為白蠟生發(fā)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 白蠟(四川峨眉白蠟研究所);實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：KM小鼠為5周齡雄鼠[成都達(dá)碩科技有限公司，證書(shū)號(hào)：3 cdk(川)2013-24]，室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度為室溫，光照為自然光，飼喂人工飼料，食物和水不限量供應(yīng);HFDPC和人毛囊真皮乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(美國(guó)Cell Applications公司);丙酸睪酮(杭州動(dòng)物藥品廠);非那雄胺(大連美侖生物技術(shù)有限公司);Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(美國(guó)Promega公司);滅菌大豆油為食品級(jí)大豆油150℃干熱滅菌4 h;無(wú)水乙醇和1，2-丙二醇為分析級(jí)。

1.2 樣品制備 丙酸睪酮溶解于滅菌大豆油，濃度為5 mg/m L;非那雄胺用有機(jī)溶劑(乙醇∶丙二醇=80∶20)配制，濃度為2%;高級(jí)烷醇用有機(jī)溶液(乙醇∶丙二醇=80∶20)配制，濃度分別為0.5%、1.0%、2.0%，備用;稱取適量T和非那雄胺溶解于95%乙醇中制備成濃度為1 mol/L的T溶液和濃度為10μg/m L的非那雄胺溶液，備用;稱取適量乙二胺四乙酸(EDTA)溶解于蒸餾水中，濃度為10 mg/m L，備用。

1.3 動(dòng)物分組與處理 將36只KM小鼠隨機(jī)分成6組，每組6只。動(dòng)物模型的建立參照RENUKA等[5]的報(bào)道。6組分別為CK組(不進(jìn)行任何處理)、模型組(皮下注射丙酸睪酮0.1 m L)、陽(yáng)性對(duì)照組(皮下注射丙酸睪酮0.1 m L加局部涂抹2%非那雄胺0.5 m L)、實(shí)驗(yàn)組(皮下注射丙酸睪酮0.1 m L的同時(shí)局部分別涂抹5.0%、10.0%和15.0%白蠟0.5 m L)，連續(xù)給藥60 d。

1.4 激素含量的測(cè)定 給藥第60日每組隨機(jī)選3只小鼠，采集心臟血，室溫靜置30 min，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心10 min，用一次性注射器抽取上層血清。采用睪酮(T)和雌二醇(E2)酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定小鼠血液中T和E2的含量。測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450 nm，重復(fù)3次。采用Excel表繪制標(biāo)準(zhǔn)濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，將樣品OD值代入回歸方程中計(jì)算樣品中激素的含量。

1.5 5α-還原酶提取 取4周齡體質(zhì)量為18～22 g健康的KM小鼠，禁食不禁水，過(guò)夜脫頸處死，在冰上提取小鼠附睪，剪碎，稱重，加入3倍量預(yù)冷均漿液，在玻璃勻漿器中勻漿，勻漿液于4℃、3 500 g離心10 min，離心2次。取上清液，再次于4℃、10 000 g離心50 min，取上清液，分裝。保存于-80℃冰箱，用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白含量。

1.6 白蠟對(duì)5α-還原酶的抑制作用 在5 mL的離心管中添加0.1 mL 1 mmol/L睪酮溶液、0.1 mL EDTA水溶液、0.3 mL的5α-還原酶和0.3 mL不同濃度白蠟溶液(濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL)或非那雄胺溶液(濃度分別為0.012 5、0.062 5、0.125 0、0.250 0 mg/mL)，用 20 mmol/L磷酸鈉溶液補(bǔ)足到1.5 m L，混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60 min，加入3 m L乙酸乙酯終止反應(yīng)。漩渦震蕩1 min，3 500 rpm離心10 min，取有機(jī)層，蒸干，添加2 m L甲醇。采用高效液相(HPLC)測(cè)定T的含量，根據(jù)T標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品反應(yīng)后溶液中殘留的T含量。按照下列公式計(jì)算：T反應(yīng)量=C0min-C60min，C為反應(yīng)體系中T的量;T轉(zhuǎn)化率=(Mck-M樣品)/Mck×100%，M為T(mén)的轉(zhuǎn)化量;5α-還原酶抑制率=(Rck-R樣品)/Rck×100%。

1.7 白蠟抑制二氫睪酮與受體的結(jié)合 采用MTS法測(cè)定白蠟對(duì)二氫睪酮與受體結(jié)合的抑制作用。HFDPC(2.5×103個(gè)/孔)接種到96孔板中，貼壁后在每個(gè)孔中添加終濃度為1×10-4的二氫睪酮溶液，同時(shí)添加終濃度為5、2.5、1.26、0.625μg/m L的白蠟，以0.2μmol/L非那雄胺溶液為陽(yáng)性對(duì)照，只添加T溶液的細(xì)胞作為空白對(duì)照，每個(gè)處理4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)在37℃條件下培養(yǎng)48 h。每孔加20μL MTS試劑培養(yǎng)4 h，490 nm測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(OD處理組-ODCK組或模型組)/ODCK組或模型組×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組計(jì)量資料比較采用ANOVA法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激素水平比較 白蠟組T含量隨著白蠟濃度的增加而增加。給藥60 d后，5%、10%的白蠟組T含量明顯低于模型組(P＜0.05)，高于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)。10%白蠟組E2含量均明顯高于5%、20%白蠟組、陽(yáng)性對(duì)照組和模型組(P＜0.05)，T/E2明顯小于模型組(P＜0.05)，大于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 給藥第60 d后各組雄激素性脫發(fā)模型小鼠激素比較(±s)

表1 給藥第60 d后各組雄激素性脫發(fā)模型小鼠激素比較(±s)

注：與模型組比較，△P＜0.05;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，▲P＜0.05

組別 只數(shù) T(pmol/L) E2(pmol/L) T/E2 CK組 3 1 337 887.80±11 659.48△▲ 187.49±15.07△▲ 718.13±65.90△模型組 3 154 983.20±13 966.57▲ 179.44±12.76 873.22±97.68▲陽(yáng)性對(duì)照組 3 119 240.80±3 022.49△ 180.64±4.21△ 660.93±24.56△5%白蠟組 3 132 769.50±1 142.05△▲ 179.66±22.75△ 762.23±91.87△▲10%白蠟組 3 139 994.30±3 282.15△▲ 192.41±2.44△▲ 727.77±18.11△▲20%白蠟組 3 154 961.60±11 957.80▲ 172.51±6.69△▲ 897.13±50.95△▲

2.2 對(duì)5α-還原酶的抑制作用比較 白蠟和非那雄胺可以明顯降低T轉(zhuǎn)化二氫睪酮的能力，抑制5α-還原酶的活性。隨著二者濃度的增加，T的反應(yīng)量和轉(zhuǎn)化率均降低，5α-還原酶的抑制率增加。白蠟和非那雄胺對(duì)5α-還原酶的抑制中濃度分別為1.66μg/m L、0.07μg/m L。見(jiàn)表2、表3。

表2 白蠟對(duì)5α-還原酶的抑制作用

表3 非那雄胺對(duì)5α-還原酶的抑制作用

2.3 白蠟抑制二氫睪酮與受體的結(jié)合 隨著白蠟濃度的增加，HFDPC增殖率降低。白蠟濃度為0.063 ppm時(shí)，對(duì)二氫睪酮模型細(xì)胞的增殖效果最為明顯，其值與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);濃度為1.56 ppm時(shí)HFDPC的增殖率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)，與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);白蠟濃度高于3.12 ppm時(shí)，細(xì)胞增殖率明顯降低，且低于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 白蠟對(duì)二氫睪酮模型細(xì)胞的增殖作用

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道顯示，激素水平紊亂是導(dǎo)致雄激素性脫發(fā)的主要原因[1，6-7]。T與E2是維持體內(nèi)激素水平的重要激素，與性別關(guān)系密切。對(duì)女性而言，T和E2均由機(jī)體直接分泌;對(duì)于男性而言，T由機(jī)體直接分泌，其在芳香酶的作用下可產(chǎn)生E2。正常情況下，T與E2共同維護(hù)機(jī)體激素水平的平衡。若機(jī)體激素水平失衡則會(huì)對(duì)毛囊的生長(zhǎng)造成較大的危害。因此，調(diào)節(jié)體內(nèi)T和E2的含量，使其比值維持在正常范圍是治療雄激素脫發(fā)的有效措施之一[8]。本實(shí)驗(yàn)中，筆者通過(guò)測(cè)定小鼠體內(nèi)T、E2的含量，計(jì)算T與E2的比值，評(píng)價(jià)白蠟對(duì)激素的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，皮下注射丙酸睪酮建立雄激素性脫發(fā)模型小鼠，給藥60 d后，小鼠體內(nèi)的T/E2比值明顯升高，局部涂抹10%白蠟后小鼠體內(nèi)T/E2比值明顯低于模型組(P＜0.05)，與CK組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明白蠟?zāi)苷{(diào)節(jié)雄激素性脫毛模型小鼠體內(nèi)紊亂的激素水平。

雄激素性脫發(fā)激素水平的紊亂并不是T直接作用的結(jié)果，而是頭部大量集聚的T在Ⅱ型5α-還原酶催化下產(chǎn)生的二氫睪酮穿透細(xì)胞膜與雄激素性受體結(jié)合后，進(jìn)入毛囊細(xì)胞，破壞DNA的表達(dá)，誘發(fā)HFDPC衰退[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，抑制5α-還原酶活性及阻止雄激素與受體結(jié)合是雄激素性脫發(fā)藥物作用的靶標(biāo)位點(diǎn)，某些外源性的物質(zhì)能抑制5α-還原酶活性，阻止二氫睪酮對(duì)HFDPC的傷害[10]。目前國(guó)際上公認(rèn)的治療雄激素脫發(fā)的藥物非那雄胺可同時(shí)作用于這兩個(gè)位點(diǎn)[11-13]。本次研究結(jié)果顯示，白蠟?zāi)軌蛞种?α-還原酶活性，降低T轉(zhuǎn)化率，同時(shí)一定濃度范圍內(nèi)還能促進(jìn)二氫睪酮誘導(dǎo)的HFDPC增殖，其抑制5α-還原酶的濃度高于陽(yáng)性對(duì)照組(非那雄胺)(P＜0.05)，而白蠟用量為0.063 ppm時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖效果與非那雄胺比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明白蠟?zāi)軌蛞种?α-還原酶活性，一定濃度范圍內(nèi)可阻止二氫睪酮與受體的結(jié)合，其抑制5α-還原酶活性低于非那雄胺，但一定濃度時(shí)其阻止二氫睪酮與受體結(jié)合的能力與非那雄胺無(wú)差異。

本研究結(jié)果顯示，白蠟?zāi)芙档托∈篌w內(nèi)T的表達(dá)量。由于雄性小鼠不能直接分泌E2，其由T在芳香酶的催化下生成。由此推測(cè)，白蠟對(duì)芳香酶的活性或其催化T生成E2的生化過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，白蠟對(duì)雄激素及其代謝過(guò)程均具有調(diào)節(jié)作用，其可通過(guò)調(diào)節(jié)紊亂的激素水平，抑制5α-還原酶活性，阻止二氫睪酮與受體的結(jié)合，促進(jìn)雄激素性脫發(fā)毛發(fā)的生長(zhǎng)。