李詩言，王鼎南，周凡，柯慶青，貝亦江，吳洪喜，丁雪燕，王揚(yáng)

(浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，杭州 310023)

五氯酚(pentachlorphenol,PCP)是一種氯代酚農(nóng)藥，曾作為高效的除草、殺蟲和防腐試劑在世界范圍內(nèi)被廣泛使用。20世紀(jì)60年代，為了預(yù)防吸血蟲病，中國大量使用五氯酚及其鈉鹽用于消滅釘螺，近年來漁業(yè)養(yǎng)殖過程中也存在著非法使用五氯酚清塘等情況[1-2]。五氯酚具有強(qiáng)烈的遺傳毒性和生理毒性，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，已成為重點監(jiān)控的環(huán)境污染物之一，被多個國家禁止使用[3-5]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部早在2002年便發(fā)布公告[6]規(guī)定所有食品動物中不得檢出五氯酚鈉。五氯酚可在水生動物體內(nèi)蓄積，帶來的食品安全風(fēng)險不容忽視，因此近年來水產(chǎn)品中五氯酚殘留的監(jiān)控有著加強(qiáng)的趨勢。在國家市場監(jiān)管總局發(fā)布最新的2019年食品安全監(jiān)督抽檢計劃[7]中，大宗水產(chǎn)品均新增加了五氯酚鈉(以五氯酚計)檢測項目。

五氯酚及其鈉鹽常見的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10-12]、液相色譜法(LC)[13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[14-16]等。GC和GC-MS法需要衍生化，前處理操作繁瑣；LC法基質(zhì)干擾多，定性能力不足；LC-MS/MS法特異性強(qiáng)，靈敏度高，且前處理無需衍生，近年來已廣泛應(yīng)用在生物樣品中五氯酚殘留測定。目前LC-MS/MS分析水產(chǎn)品中五氯酚及其鈉鹽殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法是2016年發(fā)布的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.92—2016[17]，然而該方法存在著前處理耗時長，易受復(fù)雜基質(zhì)干擾的問題。為此，本研究旨在建立水產(chǎn)品中五氯酚及其鈉鹽的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，在標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，通過對色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化以及樣品前處理參數(shù)的改良，提升原方法的抗基質(zhì)干擾能力，進(jìn)一步提高方法的檢測效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要實驗儀器包括：1200系列液相色譜儀(美國Agilent公司)；4000 Qtrap 三重四級桿質(zhì)譜儀(美國 SCIEX 公司)；Multi Reax全能型振蕩器(德國 Heidolph 公司)；Allegra X-12高速離心機(jī)(美國 BECKMAN 公司)和N-EVAP112水浴式氮吹濃縮儀(美國Organomation Associates，Inc)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括：甲醇中五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科監(jiān)測所)和13C6-五氯苯酚(1mg，F(xiàn)irst Standard)。

主要耗材及試劑包括：Oasis MAX固相萃取柱和MAX LP固相萃取柱(60 mg/3mL，美國Waters公司)；乙腈、甲醇(色譜純，美國TEDIA公司)；三乙胺、氨水(分析純，上海麥克林生化試劑有限公司)；甲酸(色譜純，美國ROE scientific INC.)和乙酸銨(色譜純，美國Fisher公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取適量五氯酚及其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液準(zhǔn)確配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液以及質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20 ℃儲存。

1.3 樣品制備

樣品采自浙江省某養(yǎng)殖場，品種包括南美白對蝦(Penaeusvannamei)、中華絨螯蟹(EriocheirsinensisH.Milne-Edwards)和烏鱧(OphiocephalusargusCantor)。蝦類樣品去頭去尾去殼后取肌肉組織，蟹類樣品將主體軀干部分去殼去鰓后取可食部分，魚類樣品取肌肉組織，肉質(zhì)樣品均放入攪拌機(jī)中制為勻漿狀，置于-20 ℃凍藏備用。

1.4 樣品前處理

優(yōu)化后樣品前處理過程如下：準(zhǔn)確稱取均質(zhì)樣品2.00 g，置于50 mL帶蓋的離心管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)工作液，加入12 mL 70%(V/V)的乙腈水溶液(含5% 三乙胺，V/V)于離心管中，充分渦旋混勻5 min，以8 000 r/min高速離心5 min。將上述帶基質(zhì)樣品提取液全部加于MAX LP柱(預(yù)先分別用3 mL甲醇和3 mL水潤洗)，再依次用5 mL 5%氨水(V/V)溶液、5 mL甲醇以及5 mL 50%(V/V)的甲醇水溶液(含2% 甲酸，V/V)進(jìn)行淋洗，棄去流出液，最后用5 mL的4%甲酸甲醇溶液洗脫，采用帶刻度15 mL離心管收集洗脫液，并在40 ℃下氮吹至1 mL，用水定容至2 mL后過0.22 μm有機(jī)相濾膜，上機(jī)待測。未優(yōu)化前處理過程參照標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.92—2016[17]。

1.5 LC-MS/MS條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×150.0 mm，3.5 μm)；流動相A為甲醇，流動相B為5 mmol/L乙酸銨水溶液；柱溫為40 ℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。梯度洗脫程序：0～3.0 min，60% B；3.0～6.0 min，60% ～2% B；6.0～8.0 min，2% B；8.0～8.1 min，2%～60% B；8.1～10min，60%B。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源模式為ESI-，離子源溫度550 ℃，電噴霧電壓-4 500 V，霧化氣(GS1)壓力345 kPa，輔助氣(GS2)壓力379 kPa，氣簾氣(CUR)壓力172 kPa，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometric parameters for target compounds

注：*表示定量離子?！硎緹o。PCP為五氯酚(pentachlorophenol)，13C6-PCP為五氯酚-13C6(pentachlorophenol-13C6)。下同。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果分析

選用處理后的南美白對蝦、中華絨毛蟹及烏鱧空白樣品各5份，每份樣品均加標(biāo)5 μg/kg。采用GB 23200.92—2016標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定，基質(zhì)加標(biāo)配置標(biāo)曲，外標(biāo)法定量，檢測結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)方法對于中華絨毛蟹樣品的適用性較差，其中一個樣品的加標(biāo)回收率低于70.0%，且總體平均回收率為77.1%(RSD值為8.2%)，低于南美白對蝦的84.0%(RSD值為3.2%)和烏鱧的83.2%(RSD值為3.7%)。實驗中還發(fā)現(xiàn)，中華絨毛蟹基質(zhì)含有蟹黃等油性物質(zhì)，在MAX小柱上樣過程中容易發(fā)生堵柱情況，通過加壓或者真空反壓可以緩解堵柱情況，但會影響小柱對目標(biāo)化合物的保留性能，導(dǎo)致回收率下降。在標(biāo)準(zhǔn)方法附錄C的不同基質(zhì)五氯酚加標(biāo)回收率匯總表中[17]，蟹類基質(zhì)在1 μg/kg水平添加濃度時樣品的回收率下限值僅為66.7%，表明標(biāo)準(zhǔn)方法對于蟹類基質(zhì)適用性存在不足。

表2 使用GB 23200.92—2016標(biāo)準(zhǔn)方法測定水產(chǎn)品中五氯酚殘留實驗結(jié)果Tab.2 Determination of PCP in aquatic product samples by the standard method GB 23200.92—2016

此外，為了獲取更好的質(zhì)譜響應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)方法采用“母離子找母離子”的MRM離子通道，但在本研究實際樣品檢測中發(fā)現(xiàn)，部分樣品的離子對存在雜峰干擾，影響了檢測的準(zhǔn)確性。針對上述問題，本研究從前處理和儀器條件方面著手，對標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。

2.2 檢測方法優(yōu)化

2.2.1 定量方式的優(yōu)化

穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法是LC-MS/MS分析中校準(zhǔn)基質(zhì)效應(yīng)的常見手段[18]，由于同位素內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)化合物理化性質(zhì)非常接近，同時可進(jìn)一步校準(zhǔn)提取過程中的損失，因此定量穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性通常要優(yōu)于非同位素內(nèi)標(biāo)法。標(biāo)準(zhǔn)方法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量五氯酚殘留，由于不同種類樣品基質(zhì)效應(yīng)存在差別，因此每個品種基質(zhì)樣品均要建立相應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線來校準(zhǔn)基質(zhì)效應(yīng)。本研究選擇13C6-PCP作為PCP的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，通過內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，采用純試劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以簡化實驗。

2.2.2 質(zhì)譜、色譜條件的優(yōu)化

五氯酚為酸性化合物，含有羥基，因此采用負(fù)源進(jìn)行分析，主要形成準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-。由于氯離子存在35Cl和37Cl兩種同位素，含有5個氯離子的五氯酚能夠形成具有不同質(zhì)量數(shù)的同位素離子峰簇，因此標(biāo)準(zhǔn)方法選用m/z262.7、264.7、266.7和268.7 這4個同位素離子峰作為母離子，以4個母離子識別獲得4個得分點，滿足相關(guān)法規(guī)[19]對LC-MS/MS分析定性的點數(shù)要求。然而，質(zhì)譜MRM掃描方式中的“母離子找母離子”模式相比“母離子找子離子”模式更易受到樣品基質(zhì)干擾。為此，本研究對五氯酚的二級質(zhì)譜碎裂情況進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)五氯苯酚的苯環(huán)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定較難碎裂，4個同位素母離子主要二級碎片均為氯離子。通過質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，選擇碎片離子m/z35.1豐度最高的m/z262.7和m/z264.7作為母離子，以兩個不同母離子分別找一個子離子的情況獲得5個得分點。此時，目標(biāo)化合物離子對通道基線較低，抗干擾能力強(qiáng)，優(yōu)化后五氯酚及其同位素內(nèi)標(biāo)的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

本研究考察了甲醇和乙腈流動相體系對五氯酚色譜行為的影響，結(jié)果表明，以甲醇作為有機(jī)相時，響應(yīng)強(qiáng)度提升了近1倍，且水相中加入緩沖鹽(乙酸銨水溶液)可有效改善目標(biāo)化合物的峰形，因此，最終選擇甲醇和乙酸銨水溶液作為流動相，與標(biāo)準(zhǔn)方法保持一致。此外，研究還發(fā)現(xiàn)出峰時流動相的高有機(jī)相比例能夠提高五氯酚的響應(yīng)強(qiáng)度，因此進(jìn)一步優(yōu)化了流速和梯度條件，使其出峰時間保持在98%的高有機(jī)相階段。優(yōu)化后的色譜條件見1.5.1節(jié)，五氯酚及其同位素內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖見圖1。

圖1 五氯酚和13C6-五氯酚MRM色譜圖Fig.1The extracted ion chromatography of pentachlorophenol (1 μg·L-1) and pentachlorophenol-13C6 (100 μg·L-1) under MRM mode

2.2.3 提取條件的優(yōu)化

五氯酚作為酸性化合物，其pKa接近5，標(biāo)準(zhǔn)方法中后續(xù)凈化采用陰離子交換小柱，要求上樣溶液(提取溶液)為堿性溶液，使五氯酚成為離子態(tài)。因此，實驗對比驗證了不同堿性提取試劑在3種水產(chǎn)品基質(zhì)中對五氯酚或其鈉鹽的單次提取效果(參照原標(biāo)準(zhǔn)以2 g樣品，12 mL提取液進(jìn)行測試)。結(jié)果表明，堿性乙腈的提取效果優(yōu)于堿性甲醇，堿性試劑三乙胺的效果優(yōu)于氨水，同時乙腈和水7∶3(V/V)配比后提取效果可進(jìn)一步獲得提升(表3)，其在南美白對蝦、中華絨毛蟹和烏鱧試驗中的平均提取率分別達(dá)到了84%、85%和87%。最終，本方法采用標(biāo)準(zhǔn)方法中的70%(V/V)的乙腈水溶液(含5% 三乙胺，V/V)作為提取試劑。研究還對提取試劑的提取次數(shù)進(jìn)行了驗證和優(yōu)化，結(jié)果表明12 mL提取液均分后，分2次和3次提取后平均提取率僅能分別增加5%和7%，考慮到本方法采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，為了減少實驗工作繁瑣性，最終采用單次提取方式進(jìn)行樣品提取。

2.2.4 凈化條件的優(yōu)化

在堿性環(huán)境中五氯酚中的酚羥基能夠與MAX小柱填料中的季銨基團(tuán)發(fā)生離子交換作用，同時由于MAX小柱填料和五氯酚均具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在疏水作用力作用下進(jìn)一步強(qiáng)化了五氯酚的保留，因此標(biāo)準(zhǔn)方法采用具有混合型陰離子交換能力的MAX小柱對五氯酚進(jìn)行保留并凈化。在SPE小柱凈化過程中，標(biāo)準(zhǔn)方法依次通過氨水淋洗液清洗掉質(zhì)譜兼容性較差的三乙胺溶液，甲醇淋洗液清洗掉僅靠疏水性吸附的雜質(zhì)，用50%(V/V)的甲醇水溶液(含2%甲酸，V/V)清洗掉弱酸性干擾物，最后用4% 甲酸甲醇溶液對目標(biāo)物進(jìn)行洗脫。本研究對標(biāo)準(zhǔn)方法的淋洗和洗脫步驟進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)4 mL的酸化甲醇洗脫液洗脫能力處于臨界值附近，部分基質(zhì)樣品不能完全洗脫五氯酚，因此，在后續(xù)實驗中增加了洗脫溶液的體積，提升至5 mL后五氯酚可完全洗脫。

表3 不同提取試劑的提取效率驗證結(jié)果Tab.3 The results of extraction efficiency by different extraction reagents n=5

在2.1節(jié)標(biāo)準(zhǔn)方法驗證工作中，研究發(fā)現(xiàn)蟹類基質(zhì)在MAX小柱上會出現(xiàn)堵柱情況，為此選擇填料粒徑更大的MAX LP小柱作為實驗材料來避免此問題的發(fā)生。MAX LP小柱填料粒徑為60 μm，相比MAX小柱的30 μm粒徑更適合黏稠樣品檢測，還可以獲得更快的過柱流速，減少樣品處理時間研究。以絕對回收率為參數(shù)，對比了MAX和MAX LP小柱的凈化能力。結(jié)果表明，MAX LP小柱可以避免MAX小柱蟹類基質(zhì)樣品堵柱問題，并提升平均絕對回收率近10%，達(dá)到了74.2%，作為替代柱，其同樣適用于南美白對蝦和烏鱧基質(zhì)(圖2)。

圖2 不同水產(chǎn)品基質(zhì)中MAX和MAX LP小柱對 PCP凈化效果對比(n=6)Fig.2Comparison of the PCP purification effects with MAX and MAX LP columns in different matrix of aquatic products(n=6)

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 方法的線性范圍、回歸方程與定量限

采用同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法，建立了6個濃度水平的系列梯度工作溶液，對目標(biāo)物進(jìn)行檢測分析。五氯酚的定量離子對峰面積與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)做內(nèi)標(biāo)定量工作曲線。五氯酚的線性方程為y=0.014 8x- 0.000 536，線性范圍為0.5～50.0 μg/L，相關(guān)系數(shù)r為0. 999 2。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行定量限(LOQ)和檢出限(LOD)驗證，以信噪比S/N大于3為本方法的LOD，信噪比S/N大于10為本方法的LOQ。優(yōu)化后五氯酚在南美白對蝦、烏鱧和中華絨毛蟹中的LOD值均為0.2 μg/kg；以0.5 μg/kg水平添加時，上述3種基質(zhì)中五氯酚的信噪比S/N分別為25、19和21，可滿足作為定量限的要求。

2.3.2 回收率和精密度

按1.4節(jié)前處理方法，取空白南美白對蝦、烏鱧和中華絨毛蟹樣品，做0.5、2.0和20.0 μg/kg 3個添加水平的加標(biāo)回收試驗，每個添加水平做6次平行測定，結(jié)果見表4。方法中五氯酚的平均回收率范圍為92.4%～102.0%，RSD為3.21%～9.15%，說明優(yōu)化后方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確且可靠。

表4 優(yōu)化方法在不同水產(chǎn)品基質(zhì)中五氯酚的加標(biāo)回收率和精密度Tab.4 The spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of pentachlorophenol in different aquatic products by the optimized method n=6

2.4 方法優(yōu)化前后對比

研究比較了標(biāo)準(zhǔn)方法與優(yōu)化后方法在儀器設(shè)備型號、進(jìn)樣量、定量限、基質(zhì)效應(yīng)、加標(biāo)回收率和樣品前處理所需時間等方面的數(shù)據(jù)。其中，基質(zhì)效應(yīng)實驗中，取3種樣品基質(zhì)均值，計算公式如下：基質(zhì)效應(yīng)(%)=(基質(zhì)空白溶液加標(biāo)信號強(qiáng)度/空白溶劑加標(biāo)信號強(qiáng)度)×100；加標(biāo)回收率實驗中，取3種基質(zhì)各5批次樣品結(jié)果均值；樣品處理時間為單批次樣品前處理所需時間。從表5可以看出，使用同型號質(zhì)譜儀器、在進(jìn)樣量減半的情況下，優(yōu)化后方法定量限從標(biāo)準(zhǔn)方法的1 μg/kg提高到了0.5 μg/kg，基質(zhì)效應(yīng)也從標(biāo)準(zhǔn)方法的16%控制到10%以內(nèi)，平均加標(biāo)回收率實驗中，由于同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法的使用更是從標(biāo)準(zhǔn)方法的81%提高到了95%，單批次樣品前處理所需時間也減少近1 h?？梢妰?yōu)化后的方法成功解決了標(biāo)準(zhǔn)方法中中華絨毛蟹的適用性問題，同時進(jìn)一步提升了方法的精密度和準(zhǔn)確度。

表5 優(yōu)化方法與GB 23200.92—2016方法比較結(jié)果Tab.5 Comparison results between the optimized method and GB 23200.92—2016 method

3 結(jié)論

相比于標(biāo)準(zhǔn)方法，本研究所建立的方法采用大粒徑MAX LP小柱，避免了檢測堵柱情況發(fā)生，顯著地改善了標(biāo)準(zhǔn)方法對蟹類樣品回收率偏低的問題，同時優(yōu)化了質(zhì)譜方法，減少了基質(zhì)干擾。運用同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量，3種水產(chǎn)品基質(zhì)中五氯酚加標(biāo)回收率均達(dá)到90%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。經(jīng)驗證，本研究測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于水產(chǎn)品中五氯酚及其鈉鹽的高效檢測工作當(dāng)中。