王鴻發(fā) 元超 龐玉新

摘 ?要??為明確艾納香抗菌藥效物質(zhì)基礎，采用硅膠柱色譜， 凝膠色譜和反相色譜等技術(shù)從艾納香乙酸乙酯部位中分離獲得15個單體化合物，經(jīng)波譜學鑒定分別為：3，3?，5-三羥基-4?，7-二甲氧基二氫黃酮?（1）、4?，5-二羥基-3，3?，7-三甲氧基黃酮?（2）、艾納香素?（3）、3，5，3?，4?-四羥基-7-甲氧基黃酮?（4）、香葉木素?（5）、3?，4?，5-三羥基-3，7-二甲氧基黃酮?（6）、異鼠李素?（7）、chrysosplenol C （8）、金絲桃苷?（9）、異槲皮苷?（10）、3?，5，7-三羥基-4?-甲氧基二氫黃酮?（11）、sakuranetin （12）、pilloin （13）、5，7，3?，4?-四羥基-3-甲氧基黃酮?（14）、5-羥基-3，7，3?，4?-四甲氧基黃酮?（15），其中化合物7、11、12和13為首次從該植物中分得?？咕钚栽u價結(jié)果顯示：化合物1、3、6、8和12對3株細菌具有不同程度的抑制活性，其中化合物3對金黃色葡萄球菌抑制活性最強， 最低抑菌濃度MIC值為32 ?g/mL。

關鍵詞 ?艾納香;化學成分;黃酮;抗菌活性中圖分類號??R284; S567??????文獻標識碼??A

Antibacterial Activity of Flavonoids from Blumea balsamifera

WANG Hongfa¹， YUAN Chao^2，3*， PANG Yuxin^2，3*

1. College of Agronomy， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing， Heilongjiang 163319， China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737， China; 3. Hainan Engineering Research Center forBlumea balsamifera（L.） DC， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract ?To investigate the pharmacodynamic substance basis ofBlumea balsamifera （L.） DC.， fifteen compounds were isolated from the EtOAc fraction by silica gel， sephadex LH-20 and ODS-A column chromatography. The structures were determined based on the analysis of the spectroscopic data as 3，3?，5-trihydroxy-4?，7-dimethoxy?flavanone （1）， 4?，5-dihydroxy-3，3?，7-trimethoxy?flavone （2）， blumeatin （3）， 3，5，3?，4?-tethydroxy-7-methoxy?flavone （4）， diosmetin （5）， 3?，4?，5-trihydroxyl-3，7-dimethoxy?flavone （6）， isosamicin （7）， chrysosplenol C （8）， hyperoside （9）， isoquercitrin （10）， 3?，5，7-trihydroxy-4?-methoxy flavanone （11）， sakuranetin （12）， pilloin （13）， 5，7，3?，4?-tetrahydroxy-3-methoxyflavone?（14） and 5-hydroxy-3，7，3?，4?-tetramethoxy?flavone （15）. Compounds7，11，12and13are isolated from the plant for the first time. Antibacterial test indicated that1，3，6，8 and12displayed different inhibition against three bacteria， and3significantly inhibitedStaphylococcus aureussubsp.aureus（DSM 799） with a MIC value of 32 ?g/mL.

Keywords ?Blumea balsamifera （L.） DC.; chemical constituents; flavonoids; antibacterial activities

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.020

艾納香Blumea balsamifera （L.） DC.屬于菊科艾納香屬植物， 別名大風艾、牛耳艾、冰片艾等，主要分布于我國云南、貴州、廣西、廣東和海南等地^?[1]。艾納香最早記載于公元741年陳藏器編著的《本草拾遺》，其性微溫，味辛、微苦，具有祛風除濕、溫中、殺蟲等功效，可用于跌打損傷、瘡癤癰腫、皮膚瘙癢等癥的治療^[2]。艾納香作為傳統(tǒng)黎藥在海南黎族百姓中通常用于婦女產(chǎn)后沐浴，以減少婦科疾病的發(fā)生^[3]。現(xiàn)代藥理學研究亦顯示，艾納香提取物具有非常好的抑菌效果，如鄒婧等^[4]報道艾納香提取物可抑制白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等口腔細菌;張穎等^[5]研究顯示艾納香揮發(fā)油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用;聞慶等^[6]報道艾渣不同提取部位對多種細菌表現(xiàn)出較強抑制活性。為進一步系統(tǒng)闡明傳統(tǒng)黎藥艾納香抗菌藥效物質(zhì)基礎，我們在前期研究基礎上，對艾納香醇提物的乙酸乙酯萃取部位進行了化學成分研究，共獲得15個單體黃酮類化合物，并對單體化合物進行了體外抗菌活性評價。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?艾納香樣品??實驗用艾納香葉片于2017年5月采自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州藥用植物種質(zhì)資源圃， 并由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所龐玉新研究員鑒定，標本存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所南藥室。

1.1.2 ?供試菌株??金黃色葡萄球菌Staphyloco ccus aureussubsp.aureus （DSM 799）， 大腸埃希菌Escherichia coli（DSM 1116） 和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis（DSM 1088） 均由青島大學藥學院李剛老師提供。

1.1.3 ?儀器與試劑??Bruker Avance-500MHz型核磁共振儀（Bruker公司）;SYNAPT G2 MS型質(zhì)譜儀（Waters Corporation， Milford， MA， USA）;Waters 2487半制備液相色譜系統(tǒng)（Waters Corporation， Milford， MA， USA）;CPA225D 精密電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）;XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新風醫(yī)療器械有限公司）;R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）;SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州廣源凈化科技有限公司）;DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海申苗醫(yī)療器械制造有限公司）;KQ-500DB型臺式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州世紀雙科實驗儀器有限公司）;ZF-7A型紫外分析儀（上海勤科分析儀器有限公司）;YMC-PACK ODS-A半制備型色譜柱（250 mm×10.0 mm，5 ?m）。sephadex LH-20葡聚糖凝膠（GE Healthcare Bio-Sciences AB， Sweden）;ODS-A反相鍵合硅膠（北京慧德易科技有限責任公司）;GF₂₅₄薄層硅膠板、柱層析硅膠（青島海洋化工廠）;硅膠柱（60 cm×8 cm，40 cm×4 cm）;凝膠柱（140 cm×2 cm，110 cm×1.5 cm）;試驗所用試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1 ?提取分離??艾納香葉片（6 kg）陰干，揉碎，用95%甲醇回流提取2次，每次提取3 h，抽濾，合并濾液，減壓濃縮成浸膏。5倍體積的水懸浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，其中乙酸乙酯相減壓濃縮得浸膏70 g，經(jīng)硅膠柱（100～200目）層析，二氯甲烷-甲醇（100∶0、99∶1、98∶2、?97∶3、95∶5、10∶1、1∶1、0∶1，V/V）梯度洗脫，各梯度分別洗脫10個柱體積，根據(jù)薄層檢測，合并得9個組分，分別編號A～?I。

組分B靜置，底部析出淺黃色粉末，濾出得到化合物1（60 mg）。濾液減壓濃縮，經(jīng)ODS-A反相柱層析，甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，V/V）梯度洗脫，每個梯度洗脫8個柱體積，根據(jù)薄層合并得7個流分（BFr.1～7），BFr.5靜置析出化合物2（30 mg）。組分C經(jīng)ODS-A反相柱層析，甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，V/V）梯度洗脫，各梯度分別洗脫8個柱體積，根據(jù)薄層合并得6個流分（CFr.1～6）。CFr.4經(jīng)sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫，得化合物8（40 mg）、11（30 mg）和12（35 mg）。CFr.5經(jīng)sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫，得到化合物13（50 mg）。CFr.6經(jīng)sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫，得化合物14（40 mg）。組分D經(jīng)ODS-A反相柱層析，甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，V/V）梯度洗脫，各梯度分別洗脫8個柱體積，根據(jù)薄層合并得到8個流分（DFr.1～8）。DFr.5靜置析出化合物3（20 mg）。DFr.6與DFr.7合并，經(jīng)HPLC制備，甲醇 水（77∶23 ，V/V）為流動相，得到化合物4（20 mg，t_R=22.3 min，流速2 mL/min）和化合物5（15 mg，t_R=22.8 min，流速2 mL/min）。DFr.4經(jīng)sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫，得到化合物6（25 mg）。組分E經(jīng)ODS-A反相柱層析，甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，V/V）梯度洗脫，各比例分別洗脫5個柱體積，根據(jù)薄層檢測得7個流分（EFr.1～7）。EFr.2經(jīng)HPLC制備，甲醇-水（1∶1，V/V）為流動相，得到化合物7（10 mg，t_R=23.8 min，流速為2 mL/min）。組分H經(jīng)ODS-A反相柱層析，甲醇-水（3∶97、5∶95、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4，V/V）梯度洗脫，每個梯度分別洗脫5個柱體積，根據(jù)薄層合并得6個流分（HFr.1～6）。HFr.1經(jīng)sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫，得到化合物15（20 mg）。組分I經(jīng)ODS-A反相柱層析，甲醇-水（3∶97、5∶95、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3，V/V）梯度洗脫，各梯度分別洗脫5個柱體積，根據(jù)薄層檢測得8個流分（IFr.1～8）。IFr.1經(jīng)HPLC制備，甲醇-水（1∶1，V/V）為流動相，得到化合物9（10 mg，t_R=10.7 min，流速為2 mL/min）和化合物10（15 mg，t_R=11 min，流速為2 mL/min）。

1.2.2 ?純度檢測和結(jié)構(gòu)確證方法??（1）純度檢測方法。純度檢驗方法采用2種不同的展開系統(tǒng)在薄層硅膠板上展開目標化合物，顯色方法為紫外燈結(jié)合碘熏，如果均為單一斑點，則表明化合物純度合格。（2）結(jié)構(gòu)確證方法。采用波譜學技術(shù)（¹H-NMR，¹³C-NMR），質(zhì)譜技術(shù)及物理性質(zhì)相結(jié)合的方法，確證純化合物結(jié)構(gòu)。

1.2.3 ?化合物抗菌活性評價方法??將保存于-80?℃的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌菌株復蘇后接種到LB培養(yǎng)基上，37?℃振蕩過夜。經(jīng)血細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整菌懸液濃度約1×10⁸CFU/mL，再用MHB培養(yǎng)基稀釋100倍至10⁶CFU/mL，作為供試菌懸液。采用96孔板倍比稀釋法^[7]測定化合物1～15對3株供試細菌的抑制活性，測定時每孔中最終菌懸液體積均為100??L，化合物1～15的濃度范圍為8～128 ?g/mL，置37?℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h，計算最低抑菌濃度（MIC），鏈霉素為陽性對照，所有實驗重復3次。

2??結(jié)果與分析

2.1結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，淺黃色粉末，ESI-MSm/z： 333.1 [M+H]⁺，分子式為C₁₇H₁₆O₇，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.00 （1H， d，J=2.5 Hz， H-2?）， 6.96 （1H， dd，J=8.5， 2.5 Hz，?H-6?）， 6.95 （1H， d，J=8.5 Hz，?H-5?），?6.08 （1H， d，J=2.0 Hz， H-6）， 6.05 （1H， d，J=2.0 Hz， H-8）， 4.98 （1H， d，J=11.5 Hz， H-2）， 4.54 （1H， d，J=11.5 Hz， H-3）， 3.87 （3H， s， 7-OCH₃）， 3.81 （3H， s， 4?-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 199.7 （C-4）， 170.7 （C-7）， 165.9 （C-5）， 165.1 （C-9）， 150.5 （C-4?）， 148.4 （C-3?）， 131.9 （C-1?）， 121.6 （C-6?），?116.5 （C-5?）， 113.2 （C-2?）， 103.4 （C-10）， 96.9 （C-6）， 95.9 （C-8）， 85.9 （C-2），?74.6 （C-3）， 57.3 （7-OCH₃）， 57.2 （4?-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]對照基本一致，故鑒定該化合物為3，3?，5-三羥基-4?，7-二甲氧基二氫黃酮（圖1）。

化合物2，淡黃色針狀結(jié)晶，ESI-MSm/z： 345.1 [M+H]⁺，分子式為C₁₈H₁₆O₇，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.72（1H， d，J=2.0 Hz， H-2?）， 7.67 （1H， dd，J=8.5， 2.0 Hz， H-6?）， 6.93 （1H， d，J=8.5 Hz， H-5?）， 6.62 （1H， d，J=2.0 Hz， H-8）， 6.32 （1H， d，J=2.0 Hz， H-6）， 3.94 （3H， s， 3-OCH₃）， 3.88 （3H， s， 3?-OCH₃）， 3.80 （3H， s， 7-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 178.7 （C-4）， 165.9 （C-7）， 161.4 （C-5）， 156.9 （C-9）， 156.8 （C-4?）， 150.5 （C-2）， 147.7 （C-3）， 138.4 （C-3?）， 122.5?（C-2?）， 121.1 （C-6?）， 115.2 （C-1?）， 111.4 （C-5?）， 105.3 （C-10）， 97.6 （C-6），?91.7 （C-8）， 59.2 （3-OCH₃）， 55.2 （3?-OCH₃）， 55.1 （7-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]基本一致，故鑒定該化合物為4?，5-二羥基-3，3?，7-三甲氧基黃酮（圖1）。

化合物3，白色粉末，ESI-MSm/z： 303.3 [M+H]⁺，分子式為C₁₆H₁₄O₆，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 6.92 （1H， s， H-4?）， 6.79 （2H， s， H-2?， 6?）， 6.05?（1H， d，J=2.5 Hz， H-8）， 6.03 （1H， d，J=2.5 Hz， H-6）， 5.31 （1H， dd，J=12.5， 3.0 Hz， H-2）， 3.80 （3H， s， 7-OCH₃）， 3.10 （1H， dd，J=17.0， 12.5 Hz， H-3b）， 2.73 （1H， dd，J=17.0， 3.0 Hz， H-3a）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 196.8 （C-4）， 168.1 （C-7）， 163.8 （C-5）， 163.3 （C-9）， 145.5 （C-3?）， 145.1 （C-5?）， 130.2 （C-1?）， 117.9 （C-4?），?114.8 （C-6?）， 113.9 （C-2?）， 102.6 （C-10）， 94.3 （C-6）， 93.5 （C-8）， 79.2 （C-2），?54.9 （7-OCH₃）， 42.7 （C-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]基本一致，故鑒定該化合物為艾納香素（圖1）。

化合物4，淺黃色粉末，ESI-MSm/z： 317.3 [M+H]⁺，分子式為C₁₆H₁₂O₇，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.72 （1H， d，J=8.0 Hz， H-6?）， 7.71 （1H， s， H-2?）， 7.01 （1H， d，J=8.0 Hz， H-5?）， 6.37 （1H， s， H-8）， 6.17 （1H， s， H-6）， 3.92 （3H， s， 7-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 175.9 （C-4）， 164.3 （C-7）， 161.1 （C-9）， 156.8 （C-5）， 149.2 （C-4?）， 146.0 （C-2）， 145.9 （C-3?）， 136.2 （C-3）， 124.0?（C-1?）， 120.1 （C-6?）， 114.2 （C-2?）， 110.7 （C-5?）， 103.1 （C-10）， 97.9 （C-6），?93.0 （C-8）， 54.9 （7-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]基本一致，故鑒定該化合物為3，5，3?，4?-四羥基-7-甲氧基黃酮（圖1）。

化合物5，黃色結(jié)晶性粉末，ESI-MSm/z： 301.3 [M+H]⁺，分子式為C₁₆H₁₂O₆，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.47 （1H， d，J=8.5 Hz， H-6?）， 7.37 （1H， s，?H-2?）， 7.06 （1H， d，J=8.5 Hz， H-5?），?6.56 （1H， s， H-8）， 6.43 （1H， s， H-3）， 6.20 （1H， s， H-6）， 3.93 （3H， s， 4?-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 182.4 （C-4）， 165.0 （C-7）， 164.5 （C-2）， 161.8 （C-9）， 158.0 （C-5）， 151.2 （C-4?）， 146.8?（C-3?）， 123.6 （C-6?）， 118.6 （C-1?）， 112.5 （C-2?）， 111.2 （C-5?）， 103.9 （C-3），?103.0 （C-10）， 98.8 （C-6）， 93.7 （C-8）， 55.1 （4?-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故鑒定該化合物為香葉木素（圖1）。

化合物6，黃色粉末，ESI-MSm/z： 331.1 [M+H]⁺，分子式為C₁₇H₁₄O₇，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.65 （1H， d，J=2.5 Hz， H-2?）， 7.56 （1H，?dd，J=8.5， 2.5 Hz， H-6?）， 6.91 （1H，?d，J=8.5 Hz， H-5?）， 6.60 （1H， d，J=2.0 Hz， H-8）， 6.34 （1H， d，J=2.0 Hz， H-6）， 3.89 （3H， s， 7-OCH₃）， 3.80 （3H， s， 3-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 180.9 （C-4）， 168.1 （C-7）， 163.6 （C-5）， 159.2 （C-2）， 159.1 （C-9）， 150.9 （C-4?）， 147.3 （C-3?）， 140.5 （C-3）， 123.6 （C-1?）， 123.2 （C-6?）， 117.4 （C-2?）， 117.2 （C-5?）， 107.5 （C-10）， 99.7 （C-6）， 93.9 （C-8）， 61.3 （7-OCH₃）， 57.3 （3-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故鑒定該化合物為3?，4?，5 -三羥基-3，7-二甲氧基黃酮（圖1）。

化合物7，黃色粉末，ESI-MSm/z： 317.3 [M+H]⁺，分子式為C₁₆H₁₂O₇，^?1H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.71 （1H， d，J=2.0 Hz，?H-2?）， 7.69 （1H， dd，J=9.0， 2.0 Hz， H-6?）， 6.99 （1H， d，J=9.0 Hz， H-5?）， 6.35 （1H， d，J=2.0 Hz， H-8）， 6.16 （1H， d，J=2.0 Hz， H-6）， 3.91 （3H， s， 3?-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 175.9 （C-4）， 164.6 （C-7）， 161.0 （C-9）， 156.8 （C-5）， 149.2 （C-4?）， 145.9 （C-2， 3?），?136.1 （C-3）， 123.9 （C-1?）， 120.0 （C-6?）， 114.2 （C-2?）， 110.7 （C-5?）， 103.0 （C-10），?98.0 （C-6）， 93.2 （C-8）， 54.9 （3?-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]基本一致，故鑒定該化合物為異鼠李素（圖1）。

化合物8，黃色粉末，ESI-MSm/z： 361.1 [M+H]⁺，分子式為C₁₈H₁₆O₈，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.71 （1H， d，J=2.0 Hz， H-2?）， 7.65?（1H， dd，J=8.5， 2.0 Hz， H-6?）， 6.92?（1H， d，J=8.5 Hz， H-5?）， 6.74 （1H， s，?H-8）， 3.96 （3H， s， 3?-OCH₃）， 3.93 （3H， s， 7-OCH₃）， 3.78 （3H， s， 3-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 178.7 （C-4）， 156.7 （C-7）， 154.5 （C-5）， 149.7 （C-9）， 147.5 （C-2）， 145.3 （C-4?）， 138.1 （C-3?）， 129.6 （C-3）， 122.3?（C-6）， 121.6 （C-1?）， 115.1 （C-6?），?111.4 （C-2?）， 105.7 （C-5?）， 105.4?（C-10），?90.3?（C-8），?59.1?（3-OCH₃），?55.5?（7-OCH₃）， 55.1?（3?-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]基本一致，故鑒定該化合物為chrysosplenol?C（圖1）。

化合物9，黃色結(jié)晶性粉末，ESI-MSm/z： 465.4 [M+H]⁺，分子式為C₂₁H₂₀O₁₂，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.84 （1H， d，J=2.0 Hz， H-2?）， 7.58 （1H，?dd，J=8.0， 2.0 Hz， H-6?）， 6.86 （1H，?d，J=8.0 Hz， H-5?）， 6.38 （1H， d，J=1.5 Hz， H-8）， 6.18 （1H， d，J=1.5 Hz， H-6 ）， 5.14 （1H， d，J=2.0 Hz， H-1?）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 178.1 （C-4）， 164.7 （C-7）， 161.5 （C-5）， 157.4 （C-9）， 157.0 （C-2）， 148.5 （C-4?）， 144.4?（C-3?）， 134.4 （C-3）， 121.5 （C-1?）， 121.4 （C-6?）， 116.4 （C-5?）， 114.7 （C-2?），?104.0 （C-10）， 103.0 （C-1?）， 98.5 （C-6）， 93.4 （C-8）， 75.7 （C-5?）， 73.7?（C-3?）， 71.8 （C-2?）， 68.6 （C-4?）， 60.5 （C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故鑒定該化合物為金絲桃苷（圖1）。

化合物10，黃色結(jié)晶性粉末，ESI-MSm/z： 465.4 [M+H]⁺，分子式為C₂₁H₂₀O₁₂，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.71 （1H， d，J=1.5 Hz， H-2?）， 7.58 （1H， dd，J=8.0， 1.5 Hz， H-6?）， 6.86 （1H， d，J=8.0 Hz， H-5?）， 6.38 （1H， d，J=1.5 Hz， H-8）， 6.18 （1H， d，J=1.5 Hz， H-6）， 5.14 （1H， d，J=2.0 Hz， H-1?）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 178.0 （C-4）， 164.7 （C-7）， 161.6 （C-5）， 157.6 （C-9）， 157.0 （C-2）， 148.4 （C-4?）， 144.5 （C-3?）， 134.2 （C-3）， 121.8 （C-1?）， 121.6?（C-6?）， 116.2 （C-5?）， 114.6 （C-2?）， 104.2 （C-10）， 100.2 （C-1?）， 98.5 （C-6），?93.4 （C-8）， 77.0 （C-5?）， 76.7 （C-3?）， 74.3 （C-2?）， 69.8 （C-4?）， 61.1?（C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定該化合物為異槲皮苷（圖1）。

化合物11，黃色結(jié)晶性粉末，ESI-MSm/z： 303.1 [M+H]⁺，分子式為C₁₆H₁₄O₆，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 6.94 （1H， d，J=2.0 Hz， H-2?）， 6.92 （1H， d，J=8.5 Hz， H-5?）， 6.90 （1H， dd，J=8.5， 2.0 Hz， H-6?）， 5.89 （1H， d，J=2.5 Hz， H-8）， 5.87 （1H， d，J=2.5 Hz， H-6）， 5.32 （1H， dd，J=12.5， 3.0 Hz， H-2）， 3.06 （1H， dd，J=17.0， 12.5 Hz， H-3b）， 2.71 （1H， dd，J=17.0， 3.0 Hz， H-3a）， 3.86 （3H， s， 4?-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 196.1 （C-4）， 167.4 （C-7）， 164.1 （C-5）， 163.3 （C-9）， 147.9 （C-4?），?146.4 （C-3?）， 131.7 （C-1?）， 117.6 （C-6?）， 113.1 （C-5?）， 111.2 （C-2?）， 101.8?（C-10）， 95.7 （C-6）， 94.9 （C-8）， 78.8 （C-2）， 55.0 （4?-OCH₃）， 42.6 （C-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故鑒定該化合物為3?，5，7-三羥基-4?-甲氧基二氫黃酮（圖1）。

化合物12，白色粉末，ESI-MSm/z： 287.1 [M+H]⁺，分子式為C₁₆H₁₄O₅，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.24 （2H， d，J=8.5 Hz， H-2?， 6?）， 6.80 （2H， d，J=8.5 Hz， H-5?， 3?）， 5.95 （1H， d，J=2.5 Hz， H-8）， 5.93 （1H， d，J=2.5 Hz， H-6）， 5.21 （1H， dd，J=13.0， 3.0 Hz， H-2）， 3.01 （1H， dd，J=17.0， 13.0 Hz， H-3b）， 2.61 （1H， dd，J=17.0， 3.0 Hz， H-3a）， 3.71 （3H， s， 7-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 196.7 （C-4）， 167.9 （C-4?）， 163.7 （C-7）， 163.1 （C-5）， 157.6 （C-9），?129.5 （C-1?）， 127.7 （C-2?， 6?）， 115.0 （C-3?， 5?）， 102.6 （C-10）， 94.4 （C-6），?93.6 （C-8）， 79.1 （C-2）， 54.9 （7-OCH₃）， 42.5 （C-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定該化合物為sakuranetin（圖1）。

化合物13，黃色粉末，ESI-MSm/z： 315.1 [M+H]⁺，分子式為C₁₇H₁₄O₆，¹H-NMR （500 MHz， DMSO）δ： 7.57（1H， dd，J=8.5， 2.0 Hz， H-6?）， 7.47 （1H， d，J=2.0 Hz， H-2?）， 7.09 （1H， d，J=8.5 Hz， H-5?），?6.81（1H， s， H-3）， 6.75 （1H， d，J=2.0 Hz， H-8 ）， 6.37 （1H， d，J=2.0 Hz， H-6）， 3.87（6H， s， 7， 4?-OCH₃）;^?13C-NMR （125 MHz， DMSO）δ： 182.3 （C-4）， 165.6 （C-4?）， 164.3 （C-7）， 161.6 （C-5）， 157.7 （C-9），?151.7 （C-2）， 147.3 （C-3?）， 123.3 （C-1?）， 119.3 （C-5?）， 113.5 （C-2?）， 112.6?（C-6?）， 105.2 （C-3）， 104.2 （C-10）， 98.5 （C-6）， 93.1 （C-8）， 56.5 （7-OCH₃）， 56.3 （4?-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，故鑒定該化合物為pilloin（圖1）。

化合物14，黃色粉末，ESI-MSm/z： 317.1 [M+H]⁺，分子式為C₁₆H₁₂O₇，¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD）δ： 7.61 （1H， d，J=2.0 Hz， H-2?）， 7.51 （1H， dd，J=8.5， 2.0 Hz， H-6?）， 6.90 （1H， d，J=8.5 Hz， H-5?）， 6.37 （1H， d，J=2.0 Hz， H-8）， 6.18 （1H， d，J=2.0 Hz， H-6）， 3.78 （3H， s， 3-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD）δ： 178.5 （C-4）， 164.5 （C-7）， 161.5 （C-5）， 156.9 （C-9）， 156.5 （C-2）， 148.5 （C-4?）， 145.0 （C-3?）， 138.1 （C-3）， 121.5?（C-1?）， 120.9 （C-6?）， 115.1 （C-5?）， 115.0 （C-2?）， 104.4 （C-10）， 98.4 （C-6），?93.4 （C-8）， 59.1 （3-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致， 故鑒定該化合物為5，7，3?，4?-四羥基-3-甲氧基黃酮（圖1）。

化合物15，黃色粉末，ESI-MSm/z： 359.1 [M+H]⁺， 分子式為C₁₉H₁₈O₇，¹H-NMR （500 MHz， CDCl₃）δ： 12.63 （1H， s， 5-OH）， 7.74 （1H， dd，J=8.5， 2.5 Hz， H-6?）， 7.68?（1H， d，J=2.5 Hz， H-2?）， 6.99 （1H， d，J=8.5 Hz， H-5?）， 6.44 （1H， d，J=2.5 Hz， H-8）， 6.34 （1H， d，J=2.5 Hz， H-6）， 3.97 （3H， s， 3-OCH₃）， 3.96 （3H， s， 3?-OCH₃）， 3.84 （3H， s， 4?-OCH₃）， 3.86 （3H， s， 7-OCH₃）;¹³C-NMR （125 MHz， CDCl₃）δ： 178.7 （C-4）， 165.4 （C-7）， 162.0 （C-9）， 156.7 （C-4?）， 155.8 （C-5）， 151.4 （C-3?）， 148.8 （C-3）， 138.9?（C-2）， 122.9 （C-1?）， 122.2 （C-6?）， 111.3 （C-5?）， 110.8 （C-2?）， 106.0 （C-10），?97.8 （C-8）， 92.2 （C-6）， 60.1 （3-OCH₃）， 56.1 （3?-OCH₃）， 55.9 （4?-OCH₃）， 55.8 （7-OCH₃）。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致，故鑒定該化合物為5-羥基-3，7，3?，4?-四甲氧基黃酮（圖1）。

2.2活性評價

結(jié)果顯示，化合物1、3、6、8和12對3株細菌具有不同程度的抑制活性，MIC值為32～128 ?g/mL（表1）。其中化合物3對金黃色葡萄球菌抑制活性最強，MIC值為32 ?g/mL，化合物12對枯草芽孢桿菌的抑制活性較強，MIC值為64 ?g/mL?；衔?b>1、6、8對3株細菌表現(xiàn)出較弱的抑制作用，其他化合物均無抑菌活性（MIC>128 ?g/mL）。

3??討論

艾納香作為傳統(tǒng)民族藥具有悠久的用藥歷史，且為《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定的天然冰片唯一來源植物^[21]，艾納香的傳統(tǒng)藥用和現(xiàn)代藥理學研究均顯示其具有很好的抗菌效果，然而其具體的抗菌成分一直不明確。目前關于艾納香化學成分研究共報道非揮發(fā)性成分80余種，其中萜類13種，黃酮類36種，其單體化合物的活性評價主要集中在抗炎和抗腫瘤方面，而抗菌方面報道很少，僅袁媛等^[22]2018年報道艾納香中6種黃酮單體化合物，并進行了抗菌活性評價。Pang等^[23]報道艾納香總黃酮成分具有保護大鼠傷口避免感染和促進傷口愈合的活性，提示艾納香黃酮類化合物可能為艾納香中的主要抗菌活性成分。元超等^[24]通過UPLC-Qtof-MS/DAD技術(shù)對艾納香不同提取部位化學成分的分析顯示，黃酮類成分主要集中在乙酸乙酯部位，而萜類成分主要分布于石油醚部位。為進一步明確傳統(tǒng)黎藥艾納香的抗菌藥效物質(zhì)基礎，本研究對乙酸乙酯部位進行了系統(tǒng)研究，共分離獲得了15個黃酮類化合物，其中化合物7、11、12和13為首次從該植物分離，通過進一步的體外抗菌活性評價，篩選出1個抗菌活性強的單體化合物-艾納香素（3），其對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）達到32 ?g/mL，其他化合物亦表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性（MIC：32～128 ?g/mL），然而仍有很多化合物無活性（MIC>128 ?g/mL），且單體化合物活性整體上并不強（陽性對照鏈霉素MIC：1～5 ?g/mL），推測艾納香發(fā)揮藥效的主要機制可能是多成分、多靶點的，且各成分間具有協(xié)同作用。