鄧大豪 鄧濤 周游 汪軍 楊臘英 郭立佳 黃俊生

摘 ?要??本研究以廣西不同品種香蕉種植地土壤微生物為研究對(duì)象，利用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)、Spearman相關(guān)性分析、RDA分析等方法對(duì)土壤微生物豐度與多樣性進(jìn)行測(cè)定分析，闡述了香蕉及種植地土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤微生物豐度與多樣性的影響。結(jié)果表明：香蕉土壤細(xì)菌樣品OTU總量與真菌樣品OTU總量比率大約是2∶1;香蕉枯萎病病原菌所在屬Fusarium占屬水平豐度5.132%～55.132%;Spearman相關(guān)性分析顯示Fusarium與土壤理化性質(zhì)無(wú)顯著相關(guān);真菌的豐度與多樣性比細(xì)菌更易受到土壤的理化性質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)元素的影響，單一土壤理化性質(zhì)無(wú)法顯著影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和物種組成;土壤真菌在一定程度上體現(xiàn)香蕉品種的抗病性程度。

關(guān)鍵詞 ?土壤微生物;擴(kuò)增子測(cè)序;香蕉;抗病性中圖分類(lèi)號(hào)??Q143??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Soil Microbial Diversity and Its Response to Soil Physical andChemical Properties under Different Banana Varieties

DENG Dahao^1，2， DENG Tao^1，2， ZHOU You¹， WANG Jun¹， YANG Laying¹， GUO Lijia¹，HUANG Junsheng^1，2*

1. Environment and Plant Protection?Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract ?In this study， soil microorganisms in different banana growing areas in Guangxi were taken as the research object. Amplicon sequencing technology， Spearman correlation analysis， RDA analysis and other methods were used to determine and analyze the abundance and diversity of soil microorganisms. The effects of physicochemical properties of banana and soil on soil microbial abundance and diversity were discussed. The results showed that the ratio of total OTU of banana soil bacterial samples to that of fungal samples was approximately 2∶1.Fusarium， the genus of the pathogen of banana wilt， accounted for 5.132% to 55.132% of the genus abundance. Spearman correlation analysis showed that there was no significant correlation betweenFusariumand soil physicochemical properties.Fusariumhad no significant correlation with soil physical and chemical properties. The abundance and diversity of fungi were more easily affected by soil physical and chemical properties and nutrients than bacteria. The single soil physical and chemical properties could not significantly affect the community structure and species composition of soil microorganisms. To a certain extent， soil fungi reflect the degree of disease resistance of banana varieties.

Keywords ?soil microbes; amplicon sequencing; banana; disease resistance

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.026

土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分循環(huán)有重大影響，是土壤和植物中介者，影響著生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能^[1--4]。土壤微生物群落對(duì)環(huán)境條件的改變很敏感，環(huán)境條件包括植被組成、溫度、降水等，環(huán)境條件的變化會(huì)導(dǎo)致微生物群落的結(jié)構(gòu)變化，微生物群落的結(jié)構(gòu)變化會(huì)導(dǎo)致土壤肥力及作物產(chǎn)率的變化^[5--7]。因此，研究香蕉種植地土壤理化性質(zhì)及香蕉抗病性對(duì)土壤微生物多樣性的影響，對(duì)于防控香蕉枯萎病具有重要意義。

香蕉（Musa spp.）為芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬植物，起源于東南亞，在世界130多個(gè)國(guó)家廣泛種植。香蕉既是重要經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物，也是僅次于水稻、小麥、玉米的第4大糧食作物^[8]。中國(guó)是世界香蕉原產(chǎn)地之一，有3000多年種植歷史。目前，根據(jù)我國(guó)主要食用蕉假莖的顏色、葉柄溝槽、果實(shí)特征及經(jīng)濟(jì)性狀，簡(jiǎn)單分為香牙蕉、大蕉、粉蕉、龍牙蕉和貢蕉5大類(lèi)^[9]。香蕉枯萎?。ㄒ喾Q(chēng)巴拿馬?。┦怯杉怄哏牭毒虐蛯?zhuān)化型[Fusariumoxysporum f. sp.cubense （Foc）]侵染所致，對(duì)生產(chǎn)影響最大的Foc是侵染幾乎所有栽培蕉的熱帶型4號(hào)生理小種（tropical race 4，TR4）^[10]。一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，香蕉枯萎病一直是香蕉商業(yè)生產(chǎn)和自給農(nóng)業(yè)種植的嚴(yán)重制約因素^[11-13]，不利于香蕉產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。香蕉枯萎病是一種典型的維管束和土傳真菌病害，也是最具毀滅性的植物病害之一^[14]。這種疾病侵襲了我國(guó)所有香蕉種植園的主要生產(chǎn)區(qū)域，病原體難以控制且在土壤中持久存在，迄今尚無(wú)有效的控制措施^[15-16]。目前的主流研究方向是生物防治，即通過(guò)篩選能夠抑制病原菌生長(zhǎng)的有益菌，再將有益菌接種到土壤里面，以期實(shí)現(xiàn)生物防控土傳病害的目的。

對(duì)香蕉及其土壤微生物的研究主要集中在復(fù)合菌劑、甘蔗渣、土壤熏蒸劑、堆肥、輪作等對(duì)香蕉、土壤酶活、微生物菌群結(jié)構(gòu)等的影響^[17-21]。張志紅等^[22]研究了不同肥料對(duì)土壤微生物功能多樣性影響以及與防病關(guān)系，發(fā)現(xiàn)肥料防病效果與土壤微生物功能多樣性變化趨勢(shì)相反;李進(jìn)等^[23]研究了堿性肥料對(duì)土壤微生物多樣性及香蕉枯萎病發(fā)生的影響，發(fā)現(xiàn)堿性肥料能有效防控香蕉枯萎病的發(fā)生;鄧曉等^[24]比較研究了香蕉枯萎病患病與健康蕉園土壤微生物群落功能多樣性，發(fā)現(xiàn)患病樣地土壤微生物群落功能多樣性明顯低于健康樣地。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)健康植株和不同感病級(jí)別植株根際土壤中的微生物數(shù)量均明顯高于非根際，就細(xì)菌和放線菌來(lái)看，感病植株的根際效應(yīng)最明顯^[25]。目前尚未有對(duì)香蕉種植地土壤微生物相對(duì)豐度和群落組成，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的功能、環(huán)境參數(shù)與細(xì)菌群落的相關(guān)性以及香蕉抗病性與土壤微生物關(guān)系的系統(tǒng)性研究。鑒于此，本文以廣西香蕉種植地為研究區(qū)，利用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)香蕉種植地土壤微生物群落功能多樣性進(jìn)行研究，以期揭示香蕉種植地土壤微生物群落豐度和組成、優(yōu)勢(shì)菌屬的功能、土壤理化性質(zhì)與微生物關(guān)系、香蕉抗病性與土壤微生物的關(guān)系，為后續(xù)防控香蕉枯萎病提供依據(jù)。

1??材料與方法

1.1樣品采集

2018年7月，每個(gè)樣地采用多點(diǎn)采樣混合法，用采樣器采集0～10 cm土壤樣品并立即用聚乙烯無(wú)菌袋密封置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，充分混勻后分為2份，1份置于-40 ℃低溫冰箱冷凍保存，在1周內(nèi)用于土壤微生物DNA的提取和分析，另1份自然風(fēng)干后研磨，用于土壤各理化指標(biāo)的測(cè)定。樣品WM11、WM12、WM21、WM22、WM31采自廣西武鳴縣培桂村，JS91、JS92、JS93采自廣西隆安金穗。其中WM11、WM12、JS91、JS92、JS93為種植1年的抗病品種桂蕉九號(hào);WM21、WM22為種植5年的較易感病品種桂蕉六號(hào);WM31為種植5年的易感病品種桂蕉一號(hào)。

1.2方法

1.2.1 ?土壤理化性質(zhì)的測(cè)定??取風(fēng)干土壤，過(guò)2 mm篩，用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定。直接用pH計(jì)測(cè)定土壤 pH，水土比2.5∶1;燒法測(cè)定土壤含水率（moisture content，MC）、有機(jī)質(zhì)含量（organic substances content，OSC）;浸提-蒸餾法（2 mol/L KCl）測(cè)定土壤銨態(tài)氮（ammonium nitrogen，NH₄⁺-N）含量;鉬銻抗比色法測(cè)定速效磷（available phosphorous，AP）含量;火焰光度計(jì)法（NH₄OAc 浸提）測(cè)定速效鉀（available potassium，AK）含量^[26]。使用北京順科達(dá)TR-8D土壤自動(dòng)記錄儀測(cè)定電導(dǎo)率（electrical conductance，EC）、鹽度（salinity，SAL）、總?cè)芙夤腆w（total dissolved solids，TDS）。

1.2.2??土壤微生物DNA提取 ??香蕉種植地土樣中微生物的DNA按照天根土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336-02）說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行提取。

1.2.3 ?16S rRNA和ITS rRNA基因的引物擴(kuò)增及高通量測(cè)序??擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)域，細(xì)菌的PCR引物是341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG -3'，806R：5'- GGAC T ACNNG GGTATC TAAT-3'。擴(kuò)增ITS rDNA的ITS1-5F區(qū)域，真菌PCR引物是ITS5-1737F：5'-GGAAGTAAAAGTC GTA ACAAGG-3'，ITS2- 20 43 R： 5'-GCTGCGTTC T TC ATC GATGC-3'。提取的土壤微生物DNA由北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序。測(cè)序基于IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái)，利用單端測(cè)序（Single-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行單端測(cè)序。

1.3數(shù)據(jù)處理

IonS5TMXL下機(jī)數(shù)據(jù)為fastq格式，使用Cutadapt軟件過(guò)濾和按barcode拆分樣本后^[27--29]，進(jìn)行97%的一致性的OTUs（operational taxonomic units）聚類(lèi)和物種分類(lèi)分析^[30]。根據(jù)OTUs聚類(lèi)結(jié)果，一方面對(duì)每個(gè)OTU的代表序列做物種注釋?zhuān)玫綄?duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況^[31]-[32]。對(duì)OTUs進(jìn)行豐度等分析，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等^[33]。同時(shí)，結(jié)合環(huán)境因素進(jìn)行RDA分析（redundancy analysis，RDA）和多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析，得到顯著影響組間群落變化的環(huán)境影響因子^[34--36]。運(yùn)用SPSS軟件對(duì)香蕉抗病性與土壤微生物進(jìn)行相關(guān)性分析。

2??結(jié)果與分析

2.1香蕉種植地微生物群落功能多樣性指數(shù)分析

細(xì)菌和真菌測(cè)序深度指數(shù)均在0.99以上。細(xì)菌香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon-Wiener）在8.084到9.498之間，辛普森多樣性指數(shù)（Simpson）在0.981以上，樣品OTU總量（observed species）在1670到2302之間。真菌Shannon-Wiener指數(shù)在4.872～6.913，Simpson多樣性指數(shù)在0.813以上，樣品OTU總量837到1164之間。細(xì)菌樣品OTU總量與真菌樣品OTU總量比率大約是2∶1。

2.2香蕉種植地的優(yōu)勢(shì)菌

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣品最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖（圖1）。Proteobacteria（17.947%～45.014%）或Actinobacteria（16.359%～41.576%）在香蕉種植地豐度最高。門(mén)水平真菌Ascomycota占30%～?75%，為最優(yōu)勢(shì)門(mén)。真菌Fusarium，Saitozy ma，Trametes為優(yōu)勢(shì)屬。香蕉枯萎病病原菌所在屬Fusarium占5.132%～55.132%。

2.3環(huán)境參數(shù)與菌群的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析是用Spearman秩相關(guān)來(lái)研究環(huán)境因子與物種之間的相互變化關(guān)系，得到兩兩之間的相關(guān)性和顯著性P值。細(xì)菌菌屬與環(huán)境參數(shù)（表1）顯著相關(guān)的有（圖2A）：Chujaibacter與電導(dǎo)率、鹽度、總?cè)芙夤腆w顯著正相關(guān)，Acid o ther mus與有機(jī)質(zhì)含量顯著負(fù)相關(guān)，Pseu d o monas與速效磷顯著正相關(guān)。Jatrophiha bitans與pH極顯著負(fù)相關(guān)。RDA分析反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系，細(xì)菌RDA的累計(jì)貢獻(xiàn)率RDA1 26.12%，RDA2 15.94%（圖3A）。影響按大小排序：鹽度>電導(dǎo)率>總?cè)芙夤腆w>速效磷>pH>有機(jī)質(zhì)含量>銨態(tài)氮。VPA分析（variance partitioning canonical correspondence analysis）研究各環(huán)境因子對(duì)微生物群落分布的解釋率。細(xì)菌中，pH、Con.、Sal.、Tot.、Org.、N、P、K分別代表pH、電導(dǎo)率、鹽度、總?cè)芙夤腆w、有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、速效磷、速效鉀。Env1為N、P、K一組，Env2為pH、Con.、Sal.、Tot.、Org.一組。Env1單獨(dú)的解釋量為18.02%，Env2單獨(dú)的解釋量為30.86%，兩組環(huán)境變量的共同解釋量為51.12%，結(jié)果表明Env2對(duì)樣本分布的影響要大于Env1。

真菌Spearman相關(guān)性分析以下顯著相關(guān)：Saitozyma與pH顯著負(fù)相關(guān)，Trametes與速效磷顯著正相關(guān)，Chaetomium與電導(dǎo)率、鹽度、總?cè)芙夤腆w顯著正相關(guān)，BisiFusarium與pH顯著負(fù)相關(guān)（圖2B）。Fusarium與環(huán)境參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)。真菌RDA分析的累計(jì)貢獻(xiàn)率RDA1 18.89%，RDA2 16.68%（圖3B）。真菌中，Env1單獨(dú)的解釋量為20.35%，Env2單獨(dú)的解釋量為41.84%，兩組環(huán)境變量的共同解釋量為37.81%，結(jié)果表明Env2對(duì)樣本分布的影響要大于Env1。

3??討論

土壤微生物的生物指標(biāo)影響著土壤的理化性質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)元素，包括土壤微生物的豐度、多樣性等方面^[23-24]。土壤微生物多樣性和其種群結(jié)構(gòu)調(diào)控著土壤各種非生物指標(biāo)，包括土壤pH、電導(dǎo)率、鹽度、總?cè)芙夤腆w、有機(jī)質(zhì)含量等。土壤pH與抑病性呈負(fù)相關(guān)，微生物群落失衡可以體現(xiàn)在土壤物理指標(biāo)^[37]。本研究中香蕉種植地的土壤pH為5.26～7.35。采集土壤2個(gè)區(qū)域?yàn)閺?qiáng)酸性，1個(gè)區(qū)域?yàn)樗嵝裕?個(gè)區(qū)域?yàn)橹行?，存在土壤酸化的危險(xiǎn)，降低抵御香蕉枯萎病的能力。平衡的土壤微生物群落是土壤健康的重要指標(biāo)。一般來(lái)說(shuō)，高質(zhì)量的土壤具有較高的細(xì)菌多樣性，但真菌多樣性低于低質(zhì)量的土壤^[38]。WM21細(xì)菌種群水平失衡，屬水平Chujaibacter（12.540%）與Acidother mus（6.847%）與其他顯著不同，樣品OTU總量最低，為1670，同時(shí)WM21真菌樣品OTU總量較高，為1041，土壤有從細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。WM21土壤酸化、鹽漬化，導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變，具有香蕉枯萎病的潛在發(fā)生危險(xiǎn)。

WM11為抗病品種桂蕉九號(hào);WM21為較易感病品種桂蕉六號(hào);WM31為易感病品種桂蕉一號(hào)。真菌樣品OTU總量是WM31>WM21>WM11，說(shuō)明在樣品中越易感病，真菌樣品豐度、多樣性指數(shù)越大。WM11真菌門(mén)水平中相對(duì)豐度超過(guò)10%的有Ascomycota和Basidiomycota，Ascomycota?（46.213%）>Basidiomycota（32.807%）;WM21真菌門(mén)水平中相對(duì)豐度超過(guò)10%的有Ascomycota和Basidiomycota，Ascomycota?（32.700%）>Basidiomy cota?（12.925%）;WM31真菌門(mén)水平中相對(duì)豐度超過(guò)10%的只有Ascomycota，Ascomycota（46.184%）>?Basidiomycota（8.991%）。在樣品中越易感病，真菌門(mén)水平中相對(duì)豐度中Ascomycota和Basidiom ycota相對(duì)豐度相差越大。WM11、WM21和WM31真菌屬水平中相對(duì)豐度Others各占45.557%、69.865%和75.502%。在樣品中越易感病，真菌屬水平中相對(duì)豐度Others占比例越高。綜上所述，感病品種和抗病品種的抗病性與土壤真菌關(guān)系較大，土壤真菌豐度、多樣性指數(shù)在一定程度上體現(xiàn)香蕉品種的抗病性程度。

以往土壤微生物多樣性的研究主要用稀釋平板法、Biolog Eco 微孔板方法、變性梯度凝膠電泳等，揭示土壤理化性質(zhì)與土壤微生物群落的關(guān)系^{[17-18， 20， 25]}。第二代高通量測(cè)序技術(shù)提供了強(qiáng)有力的工具來(lái)研究微生物的群落結(jié)構(gòu)和物種組成，更能克服傳統(tǒng)方法的局限，靈敏地檢測(cè)出環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和物種組成與外界環(huán)境的細(xì)微關(guān)聯(lián)^[21]。鄧超超等^[39]研究耕作措施對(duì)隴中旱農(nóng)區(qū)土壤細(xì)菌群落的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，秸稈覆蓋處理不僅提高了土壤細(xì)菌群落的豐度和多樣性，且特有細(xì)菌類(lèi)群也相對(duì)較高，其中尤以免耕秸稈覆蓋最為突出;尚天翠等^[40]在研究新疆野生櫻桃李林不同生態(tài)條件下土壤細(xì)菌數(shù)量變化及其影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)含量和全氮含量與細(xì)菌數(shù)量正相關(guān);劉艷霞等^[41]在研究貴州省典型植煙生態(tài)區(qū)域根際土壤微生物群落多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)區(qū)域的微生物結(jié)構(gòu)與土壤碳、氮、有機(jī)質(zhì)含量及pH與土壤微生物區(qū)系都沒(méi)有對(duì)應(yīng)關(guān)系，土壤微生物結(jié)構(gòu)是受多種因素綜合影響和決定的。本研究中Fusarium與環(huán)境參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)，但香蕉枯萎病是典型的土傳病害，帶菌土壤是主要侵染來(lái)源之一，可能需要進(jìn)一步研究到單個(gè)物種，才能通過(guò)擴(kuò)增子測(cè)序方式研究熱帶型4號(hào)生理小種與環(huán)境關(guān)系。RDA分析主成分RDA1、RDA2，貢獻(xiàn)率分別為18.89%和16.68%，表明并非單一土壤理化性質(zhì)能夠顯著地影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和物種組成，而是綜合因素共同作用的結(jié)果。在VPA分析中，真菌與細(xì)菌結(jié)果相同，Env2對(duì)樣本分布的影響要大于Env1，即pH、電導(dǎo)率、鹽度、總?cè)芙夤腆w、有機(jī)質(zhì)含量一組影響力要大于銨態(tài)氮、速效磷、速效鉀一組，真菌更易受到Env2的影響，與曹志平等^[42]研究結(jié)果相一致，即以細(xì)菌分解途徑為主導(dǎo)的土壤，能夠快速降解有機(jī)質(zhì)含量，提高氮礦化率，養(yǎng)分供應(yīng)迅速;以真菌途徑為主的土壤有利于存貯有機(jī)質(zhì)含量和固持氮，氮和能量轉(zhuǎn)化較緩慢。比較而言，前人多研究香蕉枯萎病的防治方法，不曾研究香蕉土壤理化性質(zhì)、抗病性對(duì)土壤微生物多樣性影響及普遍變化規(guī)律，本文豐富了香蕉枯萎病的研究結(jié)果。在實(shí)際應(yīng)用中，可以通過(guò)改變土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)來(lái)防治香蕉枯萎病，這對(duì)香蕉生產(chǎn)具有重要意義。

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