應曉媚,劉秀靜

(1.浙江省溫州市中醫(yī)院病理科 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，浙江溫州 325000)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，位于我國惡性腫瘤發(fā)病率的首位，其主要發(fā)病年齡為50歲及以上，男女比例為2∶1，具有明顯的地域差別[1-3]。由于早期胃癌診斷缺乏有效的特異性臨床生物學指標，且大部分早期胃癌患者無明顯臨床癥狀，所以臨床上發(fā)現(xiàn)胃癌多已屬中、晚期。有研究表明，胃癌的發(fā)生通常受到遺傳、環(huán)境等多種因素影響。隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平的不斷提高，逐漸有研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織通常會伴隨環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表達升高，且多數(shù)學者研究證實COX-2選擇性抑制劑具有良好的抗腫瘤治療效果[4-7]。腫瘤的發(fā)生基礎(chǔ)為新生血管是目前臨床醫(yī)師廣泛接受的理論，人體腫瘤細胞通過刺激炎性細胞后釋放血管新生相關(guān)因子，故血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種具有高度特異性的促進血管內(nèi)皮細胞生長的因子[8-10]。大量臨床研究表明，部分腫瘤患者血清成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)水平明顯高于身體健康者，因此腫瘤患者的血清FGF2水平可作為臨床?？漆t(yī)師進行腫瘤診斷及預后評估的潛在可靠指標[11-14]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是一種遺傳性改變，現(xiàn)通常將微衛(wèi)星不穩(wěn)定性陽性的胃癌劃分為高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性[11，15-16]。既往對于胃癌COX-2、VEGF、FGF2的表達水平及胃癌中微衛(wèi)星不穩(wěn)定研究較多，但研究COX-2、VEGF、FGF2與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性關(guān)系的相關(guān)性研究較少，故本研究選取確診為胃癌的67例患者的臨床資料進行回顧性研究，分析胃癌中COX-2、VEGF、FGF2的表達及其與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取溫州市中醫(yī)院2014年1月至2018年6月確診為胃癌的67例患者作為研究對象，其中男44例，女23例，年齡38～75歲，平均(58.12±3.59)歲，胃腸外科手術(shù)切除的胃癌及相應癌旁正常組織標本各67例用于研究胃癌中COX-2、VEGF、FGF2的表達及其與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系，標本切除后立即凍存，每個標本一部分用于DNA抽提，剩余部分由10%甲醛將其固定后石蠟包埋，切片由蘇木素-伊紅染色，所有標本均由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師做出病理診斷，排除具有腫瘤家族史及既往接受過放療和化療的患者。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色法檢測COX-2、VEGF、FGF2表達 石蠟包埋標本層厚4 μm進行連續(xù)切片后常規(guī)脫蠟，切片放置于檸檬酸緩沖液中進行微波加熱修復抗原，其一抗為濃度為1∶200的山羊抗人COX-2多克隆抗體，濃度為1∶200的山羊抗人VEGF多克隆抗體，濃度為1∶200的山羊抗人FGF2多克隆抗體，過夜孵育后進行生物素化二抗，其細胞核用蘇木素復染中性樹脂進行封片；以細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆?；蜃攸S色團塊為陽性細胞，COX-2高表達信號位于細胞質(zhì)中，以主要顯色部位為判斷標準，低表達為COX-2、VEGF、FGF2基本不著色、著色細胞低于5%或著色細胞占整張切片5%～25%，高表達為著色細胞范圍占整張切片超過25%。

1.2.2PCR檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 應用DNA提取試劑盒提取癌組織及癌旁正常組織基因組DNA，紫外分光光度法定量。DNA抽提具體步驟按照試劑盒說明書進行，研究對象的腫瘤組織基因組與正常組織基因組DNA經(jīng)電泳后確定提取成功，選取5個微衛(wèi)星位點：BAT-26、BAT-40、D2S123、D17S250、D5S346,采用同一條件進行擴增，反應體系為20 μL，其模板為200 ng，引物各15 pmol，其中dNTPs 0.5 μL,RedTaq DNA聚合酶 1.5 μL。預變性94 ℃ 2.5 min,循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 45 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s,35個循環(huán),72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后凝膠成像照相保存，將同一患者的腫瘤組織與正常組織標本所顯示的條帶進行比較。判定標準：腫瘤組織出現(xiàn)DNA條帶而正常組織未出現(xiàn)條帶則判斷為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性陽性，陽性標本重復1次，患者出現(xiàn)2個或2個以上微衛(wèi)星位點為高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，出現(xiàn)1個微衛(wèi)星位點為低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，無微衛(wèi)星位點出現(xiàn)為微衛(wèi)星穩(wěn)定性，微衛(wèi)星位點越多，則說明腫瘤發(fā)生途徑與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性越相關(guān)。其特異性引物合成序列見表1。

表1 微衛(wèi)星引物序列

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSSP22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1COX-2表達與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系 67例胃癌標本中，微衛(wèi)星穩(wěn)定性38例(56.72%)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性29例(43.28%)，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性COX-2低表達率明顯高于COX-2高表達率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性COX-2低表達率明顯高于微衛(wèi)星穩(wěn)定性COX-2低表達率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。比較高、低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及微衛(wèi)星穩(wěn)定性COX-2表達率的構(gòu)成，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 COX-2表達與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系

a：P<0.05，與同狀態(tài)COX-2高表達比較；b：P<0.05，與微衛(wèi)星穩(wěn)定性COX-2低表達比較

2.2VEGF表達與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系 67例胃癌標本中，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性VEGF高表達率明顯低于微衛(wèi)星穩(wěn)定性及低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性VEGF高表達率明顯低于同狀態(tài)VEGF低表達率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。比較高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及微衛(wèi)星穩(wěn)定性VEGF表達率的構(gòu)成，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 VEGF表達與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系

a：P<0.05，與高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性VEGF高表達比較；b：P<0.05，與同狀態(tài)VEGF高表達比較

2.3FGF2表達與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系 67例胃癌標本中，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性FGF2高表達率明顯高于微衛(wèi)星穩(wěn)定性及低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性FGF2高表達率明顯高于同狀態(tài)FGF2低表達率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。比較高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及微衛(wèi)星穩(wěn)定性FGF2表達率的構(gòu)成，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

2.4微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)PCR檢測結(jié)果 BAT-26、BAT-40、D2S123、D5S346、D17S250的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)電泳圖，見圖1。

表4 FGF2表達與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系

a：P<0.05，與同狀態(tài)FGF2高表達比較;b:P<0.05，與高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性FGF2高表達比較

N：癌旁正常組織；T：胃癌組織

圖1 5個位點的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)PCR結(jié)果

3 討論

微衛(wèi)星是基因組中的核苷酸簡單重復序列，通常為堿基重復，可用于遺傳標記、遺傳連鎖圖的構(gòu)建及基因的定位，其微衛(wèi)星不穩(wěn)定性則是因復制錯誤引起的簡單重復序列的變化，進而引起腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[17-19]。在目前的醫(yī)療研究水平下，學界認為人類大多數(shù)疾病發(fā)生的主要原因是人體遺傳物質(zhì)的突變。

胃癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在既往研究中的檢出率可達34%，說明微衛(wèi)星不穩(wěn)定性能夠作為胃癌發(fā)展過程中的診斷指標之一。本研究中高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性COX-2低表達率明顯高于COX-2高表達率，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性COX-2低表達率明顯高于微衛(wèi)星穩(wěn)定性COX-2低表達率。COX-2是在患者體內(nèi)細胞受到刺激時迅速合成的限速酶，主要調(diào)控細胞增殖與抑制細胞凋亡、促進患者體內(nèi)血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移。有研究表明，COX-2在胃癌、乳腺癌及卵巢癌等腫瘤組織中表達水平明顯降低，本研究結(jié)果表明微衛(wèi)星不穩(wěn)定性途徑發(fā)生的腫瘤通常會伴隨COX-2的低表達，與既往研究結(jié)果一致。

VEGF作為一種能夠增強微血管滲透性浸潤的強效內(nèi)皮細胞有絲分裂元，與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系。VEGF作為腫瘤血管新生最主要的刺激因子之一，能夠解釋本研究中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性胃癌存在的侵襲性及轉(zhuǎn)移性，也有部分原因可能是依賴于腫瘤活躍的微血管滲透性。本研究中胃癌VEGF高表達，占55.22%(37/67)，67例腫瘤標本中，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性VEGF高表達率明顯低于微衛(wèi)星穩(wěn)定性及低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性VEGF高表達率明顯低于同狀態(tài)VEGF低表達率，本研究在一定程度上能夠說明不同新生血管形成的途徑會造成患者VEGF的表達不同，預后較好可能與VEGF低表達相關(guān)。

FGF2存在于人體多個器官組織和細胞中，F(xiàn)GF2在惡性腫瘤組織中的表達會明顯升高，與本研究基本一致。本研究胃癌FGF2高表達45例，占67.16%；67例腫瘤標本中，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性FGF2高表達率明顯高于微衛(wèi)星穩(wěn)定性及低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性FGF2高表達率明顯高于同狀態(tài)FGF2低表達率，F(xiàn)GF2與細胞膜上相應受體結(jié)合后會導致患者體內(nèi)腫瘤細胞分裂與增殖，促進腫瘤組織新生血管的形成，導致患者腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。且既往研究表明，乳腺癌、肺癌患者血清FGF2表達會明顯高于健康人，進而證實了血清FGF2與腫瘤的相關(guān)性。

綜上所述，胃癌發(fā)生過程中可能存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)，且可能伴隨COX-2表達降低，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性胃癌存在不同的新生血管形成的途徑，其VEGF表達較低，F(xiàn)GF2表達偏高。