胡丹丹， 李 磊， 寧偎峰， 趙 瑩， 張琳琳， 胡櫟芳， 孟艷秋

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

阿霉素(Doxorubicin,DOX)，屬于蒽環(huán)類(lèi)廣譜抗腫瘤抗生素，臨床常用其鹽酸鹽，也稱(chēng)多柔比星，可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng).阿霉素細(xì)胞毒性作用強(qiáng)烈，對(duì)肝癌、甲狀腺癌、淋巴癌、肺癌的療效好，對(duì)膀胱癌、支氣管癌也有一定的作用.但是，如果靜脈注射高劑量的DOX將會(huì)引起強(qiáng)烈的心臟及脊髓毒副作用，這些缺點(diǎn)成為限制DOX臨床應(yīng)用的主要因素[1].為了提高DOX在體內(nèi)的生物利用度，減少其毒副作用，增加藥物的穩(wěn)定性，國(guó)內(nèi)外的許多學(xué)者將其載于納米微粒、脂質(zhì)體等藥物載體系統(tǒng)中，將小分子藥物與高分子載體采用納米技術(shù)相結(jié)合，利用配體與受體間的特異性親和作用，制成具有靶向性和緩釋性等優(yōu)點(diǎn)的納米藥物，從而降低藥物的毒性與不良反應(yīng)[2-3].Luten等[4]利用葉酸、聚乙二醇和聚環(huán)鄰腈制備了一種葉酸靶向載體，報(bào)告基因pCMVLacZ被包裹進(jìn)入該葉酸靶向載體；對(duì)其進(jìn)行的人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該葉酸復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率是無(wú)葉酸復(fù)合物的3倍，說(shuō)明這是一種具有潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值的靶向性基因載體.Liang等[5]為了減小基因載體的毒性并優(yōu)化其功能，利用聚乙二醇和聚乙烯亞胺既克服了轉(zhuǎn)染效率低，又高效地將質(zhì)粒DNA(pDNA)濃聚到納米粒內(nèi)部，制成了葉酸-聚乙二醇-聚乙烯亞胺/pDNA復(fù)合物，將異硫腈酸熒光素結(jié)合到這種復(fù)合物的氨基上，與葉酸受體陽(yáng)性的人胚腎上皮細(xì)胞HEK293和人腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞共孵育，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞顯著吞噬熒光物質(zhì).細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示該葉酸復(fù)合物毒性較低，葉酸復(fù)合物組轉(zhuǎn)染效率是無(wú)葉酸組的15倍，故葉酸是較為理想的靶向治療載藥系統(tǒng).

本文以一種無(wú)免疫原性、生物可降解材料牛血清白蛋白為載體，將葉酸偶聯(lián)在其表面，制備載阿霉素的白蛋白納米粒.利用配體與受體間特異性親和作用制備高載藥量和高包封率的納米粒，并對(duì)其粒徑、釋放速率等性質(zhì)進(jìn)行考察；以阿霉素粉劑為對(duì)照，考察其體外抗腫瘤活性，為葉酸偶聯(lián)阿霉素白蛋白納米粒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研制奠定基礎(chǔ)[6].

1 儀器和試劑

儀器：FA1204B電子分析天平，沈陽(yáng)龍杰儀器有限公司；馬爾文激光粒度測(cè)試儀，馬爾文帕納科有限公司；MR700型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，費(fèi)爾伯恩精密儀器(上海)有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高效液相色譜儀，安捷倫有限公司；DF-J01離心機(jī)、ZF7-熒光分光光度計(jì)，鞏義市英裕裕華儀器廠(chǎng)；透射電子顯微鏡，賽默飛世爾科技電子有限公司； JK-CI-50CH-CO2恒溫培養(yǎng)箱，上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；KDQX-100超聲波清洗機(jī)，科電超聲有限公司；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州科豐儀器有限公司；LIOO S600T-電子顯微鏡，費(fèi)爾伯恩精密儀器有限公司.

試劑：牛血清白蛋白，上海金穗生物科技有限公司；葉酸Sigma，湖北鑫潤(rùn)德化工有限公司；二環(huán)己基碳二亞胺( Acros)、N-羥基琥珀酰亞胺Sigma、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、三乙胺、二甲基亞砜(DMSO)，天津博迪化工股份有限公司；人肝癌細(xì)胞(HEPG2)、人胃癌細(xì)胞(SGC7901)，沈陽(yáng)藥科大學(xué)；磷酸鹽緩沖液(PBS)，自制.

2 方法

2.1 阿霉素白蛋白納米粒(BSANPs-DOX)的制備

稱(chēng)量白蛋白100 mg和阿霉素1 mg加入1 mL水溶解，放入25 ℃的恒溫磁力攪拌器中攪拌2 h，用NaHCO3堿溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為8～9，使用恒流泵將4 mL體積分?jǐn)?shù)為95 %的乙醇在8 min內(nèi)緩慢加入溶液中，加入體積分?jǐn)?shù)8 %的戊二醛溶液20 μL，在室溫下進(jìn)行交聯(lián)固化反應(yīng)，固化完畢后，繼續(xù)攪拌12 h，調(diào)節(jié)離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為15 000 r/min，高速離心10 min,傾去上清液，得到白蛋白納米粒懸液，超聲勻化10 min，過(guò)0.22 μm的濾膜，即可得到納米粒子[7].

2.2 葉酸活性酯的制備

準(zhǔn)備0.5 mL的三乙胺，將其緩慢加入20 mL的二甲亞砜溶液中，靜置一會(huì)使其冷卻，在冷卻好的二甲亞砜溶液中加入1 mg的葉酸粉末，用玻璃棒緩慢攪拌使其溶解，加入適量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，在室溫下使其充分反應(yīng)12 h.過(guò)濾后減壓濃縮成為干燥粉末狀物質(zhì)，用2倍體積的乙醚將剩余雜質(zhì)析出，得到淡黃色粉末，該淡黃色粉末即為葉酸活性酯.

2.3 葉酸偶聯(lián)阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/DOX)的制備

葉酸活性酯上的羧基可以與牛血清白蛋白表面的氨基酸殘基上的氨基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng).取適量阿霉素白蛋白納米粒，用緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至9，將之前制備好的黃色葉酸活性脂粉末溶解適量，加入混懸液中，攪拌均勻.用葡萄糖凝膠柱進(jìn)行上柱分離，收集先流下來(lái)的白色光亮部分液體，即可得到葉酸偶聯(lián)阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/DOX)混懸液[6].

2.4 葉酸偶聯(lián)載阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/DOX)的性質(zhì)

2.4.1 葉酸偶聯(lián)量的測(cè)定

①葉酸活性酯標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定：精密稱(chēng)取定量的葉酸活性酯，用容量瓶定量配置成40 mg/L的溶液，并用容量瓶定量稀釋質(zhì)量濃度分別為40、20、10、8、2 mg/L.全波長(zhǎng)分光光度計(jì)檢測(cè)，繪制葉酸活性酯標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).將FA-BSANPs/DOX用胰蛋白酶在37 ℃恒溫磁力攪拌器內(nèi)水解4 h，參照葉酸活性酯標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算不同牛血清白蛋白上偶聯(lián)葉酸的量.②設(shè)置對(duì)照組，即未加胰蛋白酶水解的FA-BSANPs/DOX，其他條件均相同.用全波長(zhǎng)分光光度計(jì)檢測(cè)樣品內(nèi)葉酸的含量[8].

2.4.2 形態(tài)觀(guān)察

取FA-BSANPs/DOX適量，用蒸餾水稀釋后，滴于銅網(wǎng)上制樣，用濾紙吸去多余的液體，自然晾干，于透射電鏡下觀(guān)察其形態(tài).

2.4.3 粒徑測(cè)定

取FA-BSANPs/DOX適量，用蒸餾水稀釋成適宜的濃度，采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定粒徑及粒徑分布.

2.4.4 包封率和載藥量的測(cè)定

采用超濾法對(duì)游離DOX和FA-BSANPs/DOX進(jìn)行分離.精密吸取FA-BSANPs/DOX樣品溶液0.15 mL于10 mL量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度.取稀釋后的樣品溶液于超濾裝置中進(jìn)行超濾，收集續(xù)濾液.精密吸取稀釋后的樣品溶液和續(xù)濾液0.2 mL，利用柱前衍生化-高效液相色譜法分別測(cè)定游離藥物質(zhì)量(m游)和納米?？偹幬镔|(zhì)量(m總).按照中國(guó)藥典(2015版)固體脂質(zhì)納米粒包封率的計(jì)算公式計(jì)算包封率

包封率ER=(m總-m游)/m總×100 %.

載藥量DL=(m總-m游)/mc×100 %.

式中：m總表示總藥物質(zhì)量；m游表示游離藥物質(zhì)量；mc為混合脂質(zhì)質(zhì)量.

2.5 體外釋放

取20 mg游離DOX和FA-BSANPs/DOX置于經(jīng)過(guò)預(yù)處理的透析袋中，加入5 mL PBS緩沖液(pH=7.4),用透析夾夾緊，置于盛有300 mL PBS的大燒杯中，模擬體內(nèi)環(huán)境在水浴箱中恒速震動(dòng)(37 ℃,20 r/min).分別于0.5、1、3、5、8、12、24 h吸去1 mL釋放液，并及時(shí)補(bǔ)充等量恒溫的PBS釋放介質(zhì).用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法測(cè)定不同時(shí)刻樣品上清液的光密度值，并根據(jù)前述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)轉(zhuǎn)換成DOX含量，計(jì)算每次取樣時(shí)釋放的DOX總量.上述步驟重復(fù)6次，取其平均值，制作DOX納米粒體外釋放曲線(xiàn)[8-9].

2.6 體外藥效學(xué)研究

2.6.1 測(cè)試藥品的樣品配制

白蛋白納米粒溶液(BSANPs)：制備白蛋白納米粒質(zhì)量濃度為20 g/mL的空白材料溶液，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，過(guò)0.22 μm濾膜.

阿霉素水溶液(DOX)：配制鹽酸阿霉素質(zhì)量濃度為1 g/L的鹽酸阿霉素溶液，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，過(guò)0.22 μm濾膜.

葉酸偶聯(lián)阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/DOX)：制備質(zhì)量濃度為4 g/L的FA-BSANPs/DOX溶液，并用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，過(guò)0.22 μm濾膜.

2.6.2 HEPG2細(xì)胞與SGC7901細(xì)胞的培養(yǎng)

配制含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的胎牛血清、100 U/mL青霉素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %非必需氨基酸的無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基(培養(yǎng)箱：溫度37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5 %,飽和濕度，次日更換培養(yǎng)液)，將HEPG2細(xì)胞與SGC7901細(xì)胞置于其中進(jìn)行培養(yǎng).待培養(yǎng)液中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)80 %～90 %時(shí)，吸去原有培養(yǎng)基，用PBS將細(xì)胞表面的培養(yǎng)液洗凈.取質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25 %胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的SGC7901(HepG2) 細(xì)胞，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×104～4×104/mL的單細(xì)胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板中.將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱,在 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5 % CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，等待細(xì)胞貼壁進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

2.6.3 FA-BSANPs/DOX與DOX對(duì)HEPG2細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞體外抗腫瘤活性[10-11]

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，本次實(shí)驗(yàn)所選用藥物的質(zhì)量濃度梯度為33 mg/L、11 mg/L、3.6 mg/L、1.2 mg/L、0.4 mg/L.待培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，在96孔板中分別加質(zhì)量濃度為33 mg/L、11 mg/L、3.6 mg/L、1.2 mg/L、0.4 mg/L的待測(cè)藥物DOX、BSANPs、FA-BSANPs/DOX，每濃度6個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組.將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5 % CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)72 h.培養(yǎng)72 h后，孵育結(jié)束后取出96孔板，棄去培養(yǎng)液，每孔加入冷PBS 200 μL清洗，棄去PBS，每孔再加入MTT溶液(5 g/L 20 μL)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，中止培養(yǎng)，離心棄去孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜沉淀，超聲振蕩10 min混勻.在MR700型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定490 nm處各孔吸收度 (A) 值，計(jì)算各組相對(duì)細(xì)胞活度.按公式:抑制率=[1-(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)]×100 %.計(jì)算化合物抑制50 %細(xì)胞生成時(shí)的藥物濃度，即IC50值，重復(fù)測(cè)試3次，取平均值為最終結(jié)果.

3 結(jié) 果

3.1 葉酸偶聯(lián)量的測(cè)定

葉酸活性酯在281 nm處有最大吸收峰，如圖1所示，其中1、2和3分別為葉酸活性酯標(biāo)準(zhǔn)品、胰蛋白酶水解的FA-BSANPs/DOX樣品和未水解的FA-BSANPs/DOX樣品.由圖1可見(jiàn)：對(duì)照組樣品3中無(wú)游離葉酸存在，從而證明了水解組樣品中檢測(cè)出的葉酸是已被白蛋白偶聯(lián)的部分.

1 葉酸活性酯 2 胰酶水解的載阿霉素的葉酸-白蛋白納米粒3 胰酶未水解的葉酸偶聯(lián)阿霉素白蛋白納米粒 圖1 葉酸活性酯紫外光譜Fig.1 Ultraviolet spectrogram of floate active ester

3.2 葉酸偶聯(lián)阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/DOX)形態(tài)觀(guān)察

FA-BSANPs/DOX電鏡圖如圖2所示.

圖2 葉酸偶聯(lián)載阿霉素白蛋白納米粒的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of FA-BSANPs/DOX

由圖2可見(jiàn)：FA-BSANPs/DOX呈球形，粒度較為均勻，分散性好.

3.3 FA-BSANPs/DOX粒徑分布、包封率及載藥量的測(cè)定

采用馬爾文粒度儀測(cè)定FA-BSANPs/DOX的粒徑大小，平均為(137.43±0.67) nm，90 %的粒徑小于139 nm，粒度分布較為均勻.采用柱前衍生化-高效液相色譜法測(cè)定其包封率為(89.43±0.67) %，載藥量高達(dá)(19.03±0.32)%.

3.4 體外釋放

FA-BSANPs/DOX累積釋放曲線(xiàn)如圖3所示.結(jié)果表明：0.5 h累積釋放百分率僅為(10.10±2.98) %，3 h內(nèi)累積釋放(22.45±2.72) %，24 h 累積釋放(26.71±1.38) %，說(shuō)明與DOX粉劑相比，F(xiàn)A-BSANPs/DOX釋放緩慢，并無(wú)明顯突釋現(xiàn)象.

圖3 阿霉素粉劑和葉酸偶聯(lián)載阿霉素白蛋白 納米粒的體外釋放曲線(xiàn)Fig.3 In vitro release of DOX and FA-BSANPs/ DOX microspheres

白蛋白納米粒(BSANPS)、阿霉素(DOX)和葉酸偶聯(lián)載阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/BOX)對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG2、胃癌細(xì)胞SGC7901的相對(duì)活度如圖4、圖5所示.結(jié)果表明：白蛋白納米粒(BSANPs)對(duì)HEPG2和SGC7901基本無(wú)影響，葉酸偶聯(lián)載阿霉素白蛋白納米粒的相對(duì)活度低于阿霉素粉劑，F(xiàn)A-BSANPs/DOX和DOX對(duì)高表達(dá)的人肝癌細(xì)胞HEPG2細(xì)胞的IC50值分別為4.98 μmol/L和5.13 μmol/L，對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901的IC50值分別為4.85 μmol/L和5.02 μmol/L，說(shuō)明與粉劑相比FA-BSANPs/DOX的抗腫瘤活性略強(qiáng)[12-13].

圖4 白蛋白納米粒(BSANPs)、阿霉素(DOX)和葉酸 偶聯(lián)載阿霉素白蛋白納米粒FA-BSANPs/ DOX對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG2的相對(duì)活度Fig.4 The cell viability of BSANPs、 DOX and FA-BSANPs/DOX in HEPG2

圖5 白蛋白納米粒(BSANPs)、阿霉素(DOX)和葉酸 偶聯(lián)載阿霉素白蛋白納米粒(FA-BSANPs/ DOX)對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901的相對(duì)活度Fig.5 The cell viability of BSANPs、 DOX and FA-BSANPs/DOX in SGC7901

4 結(jié)論與展望

以白蛋白為載體，利用葉酸酯結(jié)構(gòu)中的羧基與白蛋白表面的活性氨基形成配位結(jié)合物的原理，簡(jiǎn)單、方便地制備出高載藥量、高包封率的葉酸偶聯(lián)阿霉素白蛋白納米粒，載藥量高達(dá)19.03且藥物包封率較好.體外釋放研究表明所制備的FA-BSANPs/DOX顯著降低了DOX的釋放速度，具有緩釋性.體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與DOX粉劑相比，F(xiàn)A-BSANPs/DOX對(duì)HEPG2細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞的抗腫瘤活性較強(qiáng)，其原因可能是通過(guò)配位作用將阿霉素與白蛋白螯合形成納米粒后，可以促進(jìn)FA-BSANPs/DOX的細(xì)胞攝??；偶聯(lián)葉酸后，葉酸與腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體有特異性親和，從而增加了其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，抑制了HEPG2細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)，有助于抗腫瘤效果的提高.由此可見(jiàn)，葉酸偶聯(lián)載阿霉素白蛋白納米粒具有較高的應(yīng)用價(jià)值,對(duì)FA-BSANPs/DOX的體內(nèi)抗腫瘤效果以及毒性的研究是后期研究的重點(diǎn)內(nèi)容.