陳佳奇， 宋振峰， 楊海霞， 孫薪博， 馮文爽， 高恩軍

(沈陽化工大學(xué) 遼寧省無機(jī)分子基化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽 110142)

癌癥，始終是危害人類生命健康的一種頑疾，據(jù)第50屆世界衛(wèi)生組織(WHO)組織統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)每年有將近600萬人死于腫瘤，幾乎每一秒都有腫瘤患者死亡[1]，因此對抗腫瘤藥物的研究迫在眉睫，其相關(guān)實(shí)驗(yàn)必將成為醫(yī)藥、生物化學(xué)的研究重點(diǎn).目前，鉑類藥物如順鉑、奧沙利鉑是公認(rèn)的能夠有效治療多種腫瘤疾病的一類重要藥物，對食道癌，子宮癌，小細(xì)胞肺癌等具有很高的療效，但其對機(jī)體的毒副作用和抗藥性是困擾研究工作者的一大難題，迫使研究工作者尋找新型抗癌藥物[2].晶體工程金屬超分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與制造在超分子化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域中具有重要意義，選擇合適的配體在金屬超分子化合物的構(gòu)建中尤為重要，如多元配體中的羧酸配體和含氮配體就被廣泛用于金屬超分子化合物的設(shè)計(jì)與合成，含氮供體的配體由于與金屬中心的結(jié)合能力很高，常常用于構(gòu)建配位聚合物.此外，鈀(Ⅱ)具有與鉑(Ⅱ)相似的結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)而表現(xiàn)出與鉑相似的化學(xué)性質(zhì)，因此，對鈀(Ⅱ)配合物的研究引起了人們的研究興趣[3].為進(jìn)步一探究鈀混合配體配合物與DNA的作用機(jī)理，本文以吡啶-2,3-二羧酸(2,3-H2pydc)和2-氯-L-苯丙氨酸(L-2-Cl-Phe)為配體，合成了鈀配合物[Pd(2,3-H2pydc)(L-2-Cl-Phe)]，通過凝膠電泳、熒光光譜法和紫外光譜法探究了鈀配合物與DNA的作用機(jī)理.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

四氯鈀酸鉀，分析純，國藥試劑；吡啶-2,3-二羧酸(2,3-H2pydc)，分析純，上海麥克林；2-氯-L-苯丙氨酸(L-2-Cl-Phe)，分析純，蘇州愛瑪特；無水乙醇，分析純，天津大茂；CT-DNA，生化試劑，國藥試劑；pBR-322DNA、TAE緩沖溶液、Marker和Loading Buffer，生化試劑，大連TAKARA.

上海培青JS-250電泳儀；JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀；D-MS-I磁力攪拌器；AR2140電子分析天平；UV-240島津近紅外可見紫外分光光度計(jì)；Perkin Elmer LS55熒光分光光度計(jì)，KQ-100B型超聲波清洗儀；北京科偉101-2電熱鼓風(fēng)干燥箱.

1.2 配合物的合成

準(zhǔn)確稱取四氯鈀酸鉀(0.490 g)和吡啶-2,3-二羧酸(0.250 g)置于100 mL燒杯中，加入30 mL蒸餾水，超聲振蕩1 h后常溫?cái)嚢? h，再加入2-氯-L-苯丙氨酸(0.299 g)，超聲振蕩1 h后常溫?cái)嚢? h，置于100 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h后取出，研磨成粉，加入30 mL無水乙醇浸泡12 h，離心，取下層沉淀，用蒸餾水和乙醇抽濾洗滌2～3次再次置于100 ℃干燥箱中烘干24 h，研磨，得到[Pd(2,3-H2pydc)(L-2-Cl-Phe)].配合物合成路線如下所示：

1.3 紫外光譜測定

為探究配合物與DNA的作用方式，采取紫外光譜法進(jìn)行研究，這是較為直接的一種方法，同時(shí)因其價(jià)格較低，操作快捷簡單，靈敏度高的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于此類研究中[4].DNA分子所具備的特異性結(jié)構(gòu)中包含嘧啶和嘌呤堿基的共軛雙鍵，在紫外光下具有強(qiáng)吸收作用，其紫外吸收光譜會在約260 nm處產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)吸收峰[5]，過渡金屬配合物與DNA結(jié)合后，對配體所在環(huán)境產(chǎn)生一系列的影響，改變了吸收光譜的強(qiáng)度和波長，當(dāng)DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)中各個(gè)堿基平行地緊密堆疊時(shí)，將出現(xiàn)“減色效應(yīng)”，此時(shí)雙鏈DNA分子在260 nm處的吸光度值要比DNA分子中各個(gè)堿基在260 nm的吸光度值的總和還要小得多.如果DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞解開，則分子的紫外吸收將增強(qiáng)，此種現(xiàn)象被稱為“增色效應(yīng)”[6].可以通過對配合物作用前后的吸收譜帶進(jìn)行對比，從而判斷過渡金屬配合物與DNA分子的作用效果.實(shí)驗(yàn)測試方法：將500 mL濃度為0.1 mol/L的Tris溶液和420 mL濃度為0.1 mol/L的HCl混合，加水定容至1 000 mL.稱取0.016 g的CT-DNA，用Tris-HCl緩沖溶液定容至100 mL備用.稱取0.004 7 g配合物溶于10 mL水中，然后取出1 mL配合物溶液用Tris-HCl緩沖溶液定容到100 mL備用.配制7組配合物濃度為2.0×10-6mol/L，CT-DNA濃度依次為0 mol/L、4.0×10-5mol/L、8.0×10-5mol/L、1.2×10-4mol/L、1.6×10-4mol/L、2.0×10-4mol/L和2.4×10-4mol/L的混合溶液，同時(shí)將CT-DNA加入Tris-HCl緩沖溶液中配制成上述濃度作為參比液，進(jìn)行紫外光譜測試.

1.4 熒光光譜測定

除紫外光譜法外，熒光光譜法也是研究過渡金屬配合物與DNA作用方式的一種光譜學(xué)技術(shù)手段，其同樣具有選擇性好、操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，且測試樣品需求量小.當(dāng)配合物與DNA鍵合時(shí)，其熒光光譜也會受到影響而產(chǎn)生變化，因此可以通過配合物與DNA作用前后的熒光光譜變化對比，分析其作用方式[7].溴化乙錠(EtBr)是最早作為熒光探針而被廣泛應(yīng)用于抗癌藥物篩選和DNA作用研究的熒光物質(zhì)，其擁有共軛芳香環(huán)平面結(jié)構(gòu)，雖然溴化乙錠本身的熒光性能較弱，但卻可以與DNA雙鏈內(nèi)部的堿基完全平行的插入對接，形成DNA-EtBr復(fù)合物，變成更大的堆積.DNA本身不存在熒光效果，但當(dāng)EtBr分子嵌入DNA螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對之間后，EtBr分子平面剛性會顯著增強(qiáng)，同時(shí)碰撞猝滅變?nèi)?，從而增?qiáng)了熒光效果，這個(gè)效果會比游離EtBr自身的熒光效果強(qiáng)10倍.而當(dāng)體系中存在能與EtBr競爭插入DNA分子的配合物時(shí)，EtBr會被排擠出DNA分子，形成游離EtBr，從而熒光效果顯著降低.運(yùn)用這一特性，EtBr可以被作為熒光探針使用[8].根據(jù)經(jīng)典斯恩特-沃爾默(Stern-Volmer)方程：I0/I=1+Ksqr,其中：I，I0分別代表復(fù)合物體系(配合物/EtBr/DNA)中存在和不存在配合物時(shí)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度；Ksq表示斯特恩猝滅常數(shù)，其可以定量表述配位聚合物與DNA作用強(qiáng)弱；r則表示復(fù)合物中配合物與DNA的濃度比.化合物與DNA作用的強(qiáng)弱程度可以通過Ksq值的大小定量的比較，Ksq值越大，作用強(qiáng)度越大，結(jié)合能力越強(qiáng)[9].實(shí)驗(yàn)測試方法：稱取0.001 6 g的CT-DNA，用蒸餾水溶解定容至50 mL.稱取0.004 7 g配合物用蒸餾水溶解定容至100 mL備用.在5只50 mL燒杯中分別加入1 mL CT-DNA溶液，0.4 mL濃度為0.1 mmol/L的溴化乙錠溶液，避光條件下靜置反應(yīng)2 h后，加入一定量配合物溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容至20 mL，使5只燒杯中CT-DNA濃度均為5×10-6mol/L，配合物濃度依次為0 mol/L、0.5×10-6mol/L、1.0×10-6mol/L、1.5×10-6mol/L和2.0×10-6mol/L，繼續(xù)避光靜置反應(yīng)2 h.在激發(fā)狹縫為10 nm、發(fā)射狹縫為10 nm、激發(fā)波長λex=526 nm、發(fā)射波長λex=610 nm下，掃描配合物的熒光發(fā)射光譜，記錄的發(fā)射光譜范圍為540～760 nm.

1.5 凝膠電泳測定

凝膠電泳法應(yīng)用廣泛，常用于提純和鑒定核酸等研究中，同時(shí)也是分析過渡金屬配合物對DNA斷裂、解旋或嵌入能力的常用手段，其具有操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，以瓊脂糖為支持介質(zhì)的凝膠電泳技術(shù)被廣泛運(yùn)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域[10].帶電粒子在外加電場的作用下，會向著與其電性相反的電極移動(dòng)，DNA在一定pH條件下帶有負(fù)電能力，這主要是因?yàn)镈NA分子中存在親水性的磷酸基團(tuán)，在外加電場中會向著正極泳動(dòng).與其他類型電泳不同的是，除了電荷效應(yīng)外，瓊脂糖凝膠介質(zhì)的分子篩效應(yīng)也是影響DNA分子移動(dòng)的主要因素.分子篩效應(yīng)與分子量的構(gòu)型和大小有著緊密的關(guān)系，當(dāng)分子量小時(shí)，分子構(gòu)型的空間位阻就越小，遷移位置越靠前[11].本文以pBR-322質(zhì)粒DNA為研究對象，其具有3種空間構(gòu)型，分別為線性(linear)、共價(jià)閉環(huán)(ccc)和單鏈開環(huán)(oc)，當(dāng)ccc型DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)的其中一條鏈被斷裂時(shí)，產(chǎn)生oc型DNA，若ccc型DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)在同一位置斷裂，則產(chǎn)生linear型DNA，3種不同DNA構(gòu)型的緊密程度不同，其電泳移動(dòng)速度也有所差異，從而導(dǎo)致分離[12].根據(jù)這一原理，可以通過瓊脂糖凝膠電泳分析過渡金屬配合物對DNA的切割能力.實(shí)驗(yàn)測試方法如下：取50×TAE瓊脂糖電泳緩沖液20 mL，加水定容至1 L制成實(shí)驗(yàn)用電泳緩沖溶液.配制配合物濃度依次為5 mmol/L、2.5 mmol/L和1.25 mmol/L的水溶液各20 mL備用.稱取瓊脂糖1.5 g置于燒杯中，加入1 mL濃度為0.1 mmol/L的EtBr溶液，再加入180 mL電泳緩沖溶液，蓋上濾紙，放入微波爐中火加熱6 min，使之充分溶解，微微冷卻后繼續(xù)加熱3 min取出.待溫度降至70 ℃左右，迅速倒入梳孔的平板電泳床中，待瓊脂糖完全冷卻，拔去梳子.用微量進(jìn)樣器取1 μL pBR-DNA和8μL水注入小型EP管中混合均勻作為空白試驗(yàn).再分別取1μL的pBR-DNA和5 mmol/L、2.5 mmol/L、1.25 mmol/L濃度的配合物溶液各8 μL分別注入小型EP管中混勻，避光反應(yīng)2 h.向每組樣品中注入2 μL的loading buffer上樣液，混合均勻后注入到凝膠梳孔中，然后將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，倒入電泳緩沖液使液面微微沒過凝膠.在電壓80 V、電流500 mA下電泳120 min，結(jié)束后采用凝膠圖像分析儀進(jìn)行觀察并拍照保存.

2 配合物結(jié)構(gòu)

以四甲基硅烷(Tetramethylsilane,TMS)為內(nèi)標(biāo)，DMSO-d6為試劑測定配合物[Pd(2,3-H2pydc)(L-2-Cl-Phe)]的核磁共振，1H-NMR數(shù)據(jù)如表1所示.

表1 [Pd(2,3-H2pydc)(L-2-Cl-Phe)]的1H-NMR數(shù)據(jù)

測定結(jié)果表明所測配合物中共含有13個(gè)氫，其中2,3-H2pydc中羧酸上的羥基—OH的氫和與鈀配位的氨基—NH—的氫都是活潑氫，難以觀測；δ7.35～7.07(4H)為L-2-Cl-Phe結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的4個(gè)H，δ3.05～2.84(2H)為L-2-Cl-Phe結(jié)構(gòu)中苯環(huán)側(cè)鏈亞甲基—CH2—C上的2個(gè)H，δ6.27～3.53(5H)分別為吡啶環(huán)上的4個(gè)H(吡啶環(huán)上N與Pd形成配位鍵，N的鄰位加氫生成亞甲基)和與氨基相連的—CH—.綜上所述，確認(rèn)所得產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物.

3 結(jié)構(gòu)與討論

3.1 配合物對CT-DNA作用的紫外光譜研究

選取CT-DNA(小牛胸腺DNA)作為研究對象，其與配合物相互作用的紫外光譜如圖1所示.配合物在220～300 nm波長的紫外范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，這是由于芳香氮堿配體內(nèi)存在的π-π*電子躍遷而產(chǎn)生的，在加入DNA后，金屬配合物的特征吸收峰出現(xiàn)明顯的減色效應(yīng)，隨著DNA的濃度逐漸增大，趨勢也隨之明顯，這是因?yàn)榕浜衔镆圆迦氲姆绞脚cDNA螺旋堿基對結(jié)合，發(fā)生π電子堆砌作用，使其配體上π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生偶合，偶合后的π軌道因部分填充電子，導(dǎo)致π-π*躍遷幾率降低，從而產(chǎn)生減色效應(yīng)[13-15].

1.c(配合物)=2.0×10-6mol/L

2.c(配合物)=2.0×10-6mol/L+c(DNA)=4.0×10-5mol/L

3.c(配合物)=2.0×10-6mol/L+c(DNA)=8.0×10-5mol/L

4.c(配合物)=2.0×10-6mol/L+c(DNA)=1.2×10-4mol/L

5.c(配合物)=2.0×10-6mol/L+c(DNA)=1.6×10-4mol/L

6.c(配合物)=2.0×10-6mol/L+c(DNA)=2.0×10-4mol/L

7.c(配合物)=2.0×10-6mol/L+c(DNA)=2.4×10-4mol/L

圖1 金屬配合物與CT-DNA作用的紫外光譜

Fig.1 UV spectra of coordination polymer with CT-DNA

3.2 配合物對CT-DNA作用的熒光光譜研究

配合物與CT-DNA作用的熒光猝滅圖如圖2所示.金屬配合物對CT-DNA/EtBr復(fù)合物體系產(chǎn)生了影響，激發(fā)波長為526 nm時(shí)，CT-DNA/EtBr復(fù)合物在623 nm處出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，當(dāng)金屬配合物加入后，可以觀察到熒光強(qiáng)度明顯降低，且隨著加入配合物濃度的增高，熒光猝滅現(xiàn)象也愈發(fā)明顯，由此說明金屬配合物以插入方式與CT-DNA結(jié)合在一起.圖3猝滅曲線說明金屬配合物能與CT-DNA結(jié)合，其與EtBr競爭，并對CT-DNA/EtBr復(fù)合物體系發(fā)生猝滅效應(yīng)，其熒光猝滅常數(shù)用Ksq(Ksq=0.179)表示，說明金屬配合物與CT-DNA發(fā)生了插入作用.

1c(配合物)=0 mol/L

2c(配合物)=0.5×10-6mol/L

3c(配合物)=1.0×10-6mol/L

4c(配合物)=1.5×10-6mol/L

5c(配合物)=2.0×10-6mol/L

圖2 金屬配合物與CT-DNA/EtBr復(fù)合物作用的熒光光譜

Fig.2 Fluorescence spectrum of coordination polymer with CT-DNA/EtBr

圖3 金屬配合物與CT-DNA/EtBr復(fù)合物作用的猝滅常數(shù)Fig.3 Quenching constant of coordination polymer with CT-DNA/EtBr

3.3 配合物對pBR-322質(zhì)粒DNA的斷裂能力研究

配合物與pBR-322質(zhì)粒DNA的電泳圖如圖4所示.Lane0沒有加入金屬配合物，Lane1～3加入了金屬配合物，濃度依次為1.25 mmol/L、2.5 mmol/L和5 mmol/L.由圖4可以觀察到，在Lane0中只有少量DNA切割分離，形成FormⅡ；在Lane1～3中，隨著金屬配合物濃度的依次遞增，其FormⅡ也隨之依次遞增，同時(shí)FormⅠ依次遞減；由此可以說明：金屬配合物對pBR-322質(zhì)粒DNA存在一定的斷裂能力，與紫外和熒光效果一致.

圖4 金屬配合物對pBR322質(zhì)粒DNA的斷裂效果Fig.4 Coordination polymer cutting plasmid pBR-322 DNA renderings

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)合成了鈀(Ⅱ)與吡啶-2,3-二羧酸、2-氯-L-苯丙氨酸的配合物[Pd(2,3-H2pydc)(L-2-Cl-Phe)]，通過核磁手段對金屬配合物進(jìn)行了表征，證明合成的金屬配合物確為預(yù)期目標(biāo)產(chǎn)物.紫外光譜圖研究表明配合物與CT-DNA產(chǎn)生嵌插作用.熒光光譜圖研究表明配合物能與EtBr競爭嵌入DNA堿基對中.瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明配合物對pBR-322質(zhì)粒DNA有一定的切割斷裂作用，這與紫外和熒光光譜測定的結(jié)論一致.