王永慧 張文竹 張子睿 迪麗努爾·阿孜葉爾江 張 穎 羅學(xué)婭

1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，遼寧大連 116622；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧大連 116622

疼痛是困擾人類健康的嚴(yán)重問題之一，也是當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題之一。臨床上對(duì)于多種急慢性疼痛的治療，傳統(tǒng)藥物主要有阿片類和非阿片類鎮(zhèn)痛藥，雖療效肯定，但長期應(yīng)用會(huì)發(fā)生成癮性、消化性潰瘍等不良反應(yīng)。因而在豐富的中藥、天然藥物資源中尋找具有一定鎮(zhèn)痛作用，且無成癮性，不良反應(yīng)少的藥物是必要的。中藥錦帶花（Weigela florida）屬于忍冬科（Caprifoliaceae）植物，傳統(tǒng)古籍記載其具有清熱涼血解毒、活血化瘀止痛等功效，主要用于治療瘟病初起、咽喉腫痛、丹毒、感冒發(fā)熱等癥狀[1-2]。據(jù)報(bào)道，錦帶花具有抑菌[3-4]、抗流感病毒[5-6]、抑制α-葡萄糖苷酶[7]等作用。本研究基于錦帶花的功效，對(duì)其水提取物的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行探討，研究結(jié)果既可填補(bǔ)錦帶花鎮(zhèn)痛作用研究的空白，也可為開發(fā)新型、安全、具有應(yīng)用前景的鎮(zhèn)痛藥物提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)昆明種小鼠150 只，體重（21±2）g，5～6 周齡，雌雄兼用，購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXY（遼）2018-0003。屏障環(huán)境飼養(yǎng)，按照清潔級(jí)動(dòng)物管理標(biāo)準(zhǔn)管理，健康，皮毛光滑，無傷無畸形。動(dòng)物使用經(jīng)大連大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格執(zhí)行國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南。錦帶花（大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)中藥學(xué)系高松教授饋贈(zèng)）；冰醋酸（西隴化工股份有限公司）；5%鹽酸曲馬多注射液（多多藥業(yè)有限責(zé)任公司）；YLS-6B 智能熱板儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）。

1.2 方法

1.2.1 錦帶花水提取物制備 錦帶花干燥藥材25.0 g，蒸餾水600 mL 浸泡30 min 后，進(jìn)行回流冷凝，加熱煮沸30 min，趁熱過濾，收集濾液并加熱濃縮，得錦帶花水提取物200 mL（濃度0.125 g 生藥/mL），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熱板法測(cè)定錦帶花水提取物的鎮(zhèn)痛作用 雌性小鼠數(shù)只，置（55±0.5）℃熱板上，以其兩次舔后足潛伏期的均值為給藥前痛閾值[8]。選取給藥前痛閾值30 s內(nèi)的小鼠50 只，隨機(jī)分為錦帶花水提取物小、中、大劑量組（相當(dāng)于生藥0.05、0.1、0.2 g/kg，依據(jù)文獻(xiàn)[2，6，8]確定劑量），鹽酸曲馬多組（0.04 g/kg，依據(jù)文獻(xiàn)[8]確定劑量），生理鹽水組（給予等容積生理鹽水），每組10 只，灌胃給藥。依次測(cè)定各小鼠給藥后15、30、45、60、75 和90 min 的痛閾值。

1.2.3 扭體法測(cè)定錦帶花水提取物的鎮(zhèn)痛作用 雌雄各半小鼠數(shù)只，1%冰醋酸10 mL/kg，腹腔注射，選取10 min 內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的小鼠100 只，其中50 只隨機(jī)同熱板法[9]分組，灌胃給藥，10 min 后開始記錄每10 分鐘[11～20 min（T1）、＞20～30 min（T2）、＞30～40 min（T3）、＞40～50 min（T4）]內(nèi)的扭體反應(yīng)數(shù)，至50 min 為止[10]。另50 只隨機(jī)分組同上，腹腔注射給藥，記錄給藥后的扭體反應(yīng)數(shù)，并計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率，扭體反應(yīng)抑制率=（生理鹽水組扭反應(yīng)數(shù)均值-給藥組扭體反應(yīng)數(shù)均值）÷生理鹽水組扭體反應(yīng)數(shù)均值×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)經(jīng)變量轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 錦帶花水提取物對(duì)小鼠痛閾值的影響

與生理鹽水組比較，中劑量組給藥后60、75 min時(shí)及大劑量組給藥后15、45、60 min 時(shí)的痛閾值均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；鹽酸曲馬多組灌胃給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的痛閾值與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與鹽酸曲馬多組比較，除中劑量組灌胃給藥后45、75、90 min時(shí)，大劑量組給藥后45、90 min 時(shí)痛閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）外，其余各時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表1。

表1 錦帶花水提取物灌胃給藥對(duì)小鼠痛閾值的影響（s，±s，n=10）

表1 錦帶花水提取物灌胃給藥對(duì)小鼠痛閾值的影響（s，±s，n=10）

注：與生理鹽水組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與鹽酸曲馬多組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

2.2 錦帶花水提取物對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響

小、大劑量組給藥后T1～T4時(shí)段，中劑量組給藥后T3和T4時(shí)段的扭體反應(yīng)數(shù)與生理鹽水組的比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與鹽酸曲馬多組的比較，小劑量組給藥后T1、T2時(shí)段，中劑量組給藥后T1、T2、T3時(shí)段，大劑量組給藥后T2時(shí)段差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。小、中劑量組給藥后T3、T4時(shí)段，大劑量組給藥后T2、T3、T4時(shí)段的扭體反應(yīng)數(shù)與生理鹽水組的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01）。與鹽酸曲馬多組的比較，小劑量組給藥后T1、T3時(shí)段，中劑量組給藥后T1、T2、T3時(shí)段，大劑量組給藥后T1時(shí)段差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。鹽酸曲馬多組無論灌胃或腹腔注射給藥后不同時(shí)段的扭體反應(yīng)數(shù)與生理鹽水組比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表2～3。

3 討論

疼痛是臨床常見癥狀，由于對(duì)其產(chǎn)生的確切機(jī)制尚不清晰，其治療成為臨床面臨的難題之一，至今尚無有效的治療方法，亟待開發(fā)安全、有效、低毒的鎮(zhèn)痛藥物。中草藥毒副作用少，常具有多個(gè)作用靶點(diǎn)，在疼痛治療方面應(yīng)用歷史悠久。目前已知的具有止痛作用的中藥達(dá)千余種，但80%左右的藥物未進(jìn)行藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，可見開發(fā)潛力巨大。錦帶花目前仍以園藝觀賞為主[11]，在栽培和引種方面的研究報(bào)道較多[12-16]，而藥理作用的報(bào)道，除抑菌、抗流感病毒、抑制α-葡萄糖苷酶等方面外，其他報(bào)道仍是空白。本研究探討了錦帶花水提取物的鎮(zhèn)痛作用，以期進(jìn)一步發(fā)掘新的藥理活性，為研究開發(fā)具有應(yīng)用價(jià)值的中藥提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表2 錦帶花水提取物灌胃給藥對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s，n=10）

表2 錦帶花水提取物灌胃給藥對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s，n=10）

注：與生理鹽水組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與鹽酸曲馬多組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。“-”表示無數(shù)據(jù)

表3 錦帶花水提取物腹腔注射給藥對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s，n=10）

表3 錦帶花水提取物腹腔注射給藥對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s，n=10）

注：與生理鹽水組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與鹽酸曲馬多組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01?！?”表示無數(shù)據(jù)

在篩選具有鎮(zhèn)痛藥理作用的化合物、評(píng)價(jià)鎮(zhèn)痛藥物藥效強(qiáng)度等研究中，多以動(dòng)物致痛模型實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)。最常用的4 種致痛動(dòng)物模型包括小鼠熱板實(shí)驗(yàn)、小鼠甩尾實(shí)驗(yàn)、小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)以及小鼠福爾馬林實(shí)驗(yàn)等[17-18]。其中小鼠熱板實(shí)驗(yàn)對(duì)組織損傷最小，可反復(fù)利用，簡(jiǎn)便易行[19]；冰醋酸扭體法具有敏感、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)動(dòng)物通過預(yù)篩選，也可最大程度地減少因個(gè)體差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。

本研究采用傳統(tǒng)的熱板法和扭體法疼痛動(dòng)物模型，觀察錦帶花水提取物對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，錦帶花水提取物中、大劑量灌胃給藥后，痛閾值均有不同程度的提高，且在60 min 時(shí)作用表現(xiàn)最為顯著；3 種劑量錦帶花水提取物無論灌胃還是腹腔注射，給藥后扭體反應(yīng)數(shù)均有不同程度的下降，在T4時(shí)段作用表現(xiàn)最為顯著，大劑量組作用更為明顯。提示其對(duì)小鼠具有一定的鎮(zhèn)痛作用。在灌胃給藥的小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，盡管小、大劑量組給藥后T1直到T4的各個(gè)時(shí)段內(nèi)，扭體反應(yīng)數(shù)均有下降（P ＜0.01），但從扭體反應(yīng)數(shù)的均值上看，大劑量組的均值在T1、T2、T33 個(gè)時(shí)段內(nèi)相對(duì)于小劑量組都要低些。綜合分析所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，錦帶花水提取物對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用在大劑量組表現(xiàn)更為顯著。雖然錦帶花水提取物各劑量組灌胃或腹腔注射給藥后，對(duì)痛閾值或扭體反應(yīng)數(shù)的影響在一定程度上與鹽酸曲馬多比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但從數(shù)據(jù)均值上看，鹽酸曲馬多的改變更明顯些，說明鹽酸曲馬多作為陽性對(duì)照藥物，其鎮(zhèn)痛作用是明確且顯著的。

關(guān)于中藥的鎮(zhèn)痛機(jī)制，有報(bào)道指出可能與增加中樞阿片肽類的含量，抑制中樞一氧化氮的釋放，降低腦組織中前列腺素E2的含量，減少外周致痛物質(zhì)的分泌以及調(diào)節(jié)外周c-fos 基因等有關(guān)[20]。至于錦帶花水提取物對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制為何，則有待于深入研究。