張小平 于 哲 胥 云 閆 康 廖 博 周 勇 高銅拴

解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所，陜西西安 710032

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，多見于兒童和青少年，好發(fā)于血運(yùn)豐富的長骨干骺端，具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移發(fā)生早、病情進(jìn)展迅速且病死率高等特點(diǎn)，臨床治療的失敗率和死亡率較高[1]。骨肉瘤是極為難治的骨科腫瘤，其高轉(zhuǎn)移和侵襲性導(dǎo)致炎癥浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展是個復(fù)雜的過程，其中炎性因子的浸潤、成纖維細(xì)胞的激活、MAKP 信號通路的活化等，都促進(jìn)其增殖和轉(zhuǎn)移能力[2]。研究表明，PI3K/p-Smad7 信號通路在胃癌、結(jié)腸癌和肝癌等腫瘤組織中，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲作用[3-4]。PI3K/p-Smad7 可以激活腫瘤上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型的發(fā)生，同時促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)化，有文獻(xiàn)分別報道了PI3K 在骨肉瘤中的促癌作用和p-Smad7 對骨肉瘤的高轉(zhuǎn)移和侵襲性影響[5]。但是PI3K 和p-Smad7 聯(lián)合形成的分子信號通路間的相互作用和相關(guān)性，以及兩者對骨肉瘤增殖作用影響尚不完全明確。因此，本研究采用骨肉瘤患者癌組織和骨肉瘤細(xì)胞系MG-63，探討PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤中的表達(dá)及其作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017 年1 月～2018 年10 月解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院（以下簡稱“我院”）骨科收治的60 例骨肉瘤患者（骨肉瘤組織）和同期60 例軟骨組織（正常組織）為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次就診，且經(jīng)我院病理檢驗科診斷證實，均未經(jīng)任何治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有嚴(yán)重傳染性疾病和血液傳染?。虎谝缽男圆?，無法配合研究者；③合并嚴(yán)重感染、心腦血管疾病以及肝腎功能嚴(yán)重障礙者；④合并其他骨病或系統(tǒng)性疾病。本研究方法和目的均告知患者和家屬，并簽署知情同意書，研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 材料

骨肉瘤細(xì)胞系MG-63 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；蛋白定量試劑盒（P503021-0500）、SDS 凝膠試劑盒（P0012A）、細(xì)胞裂解液（P0013）、結(jié)晶紫（P8470-25g）均購自上海吉瑪生物有限公司；DMEM（SH30021）、胎牛血清（SH30406）、胰蛋白酶消化液（SV30042）購自美國HyClone；青鏈霉素混合液（P1400）、4%多聚甲醛（P1110）、苯胺藍(lán)（28631-66-5）和蘇木精（C0107）均購自武漢依科有限公司；Actin（ab179467）、PI3K（ab32089）、p-Smad7（ab114358）和兔二抗（ab150077）購自英國Abcam。PrimeScriptTMRT 試劑盒（R0047A）和SYBR（RR1297）購自中國TaKaRa。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 石蠟切塊進(jìn)行脫蠟和水化處理，抗原修復(fù)后滴加封閉液；1∶500 稀釋HGF 一抗孵育；孵育結(jié)束后用PBS 進(jìn)行沖洗，加生物素標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育；PBS 再次沖洗，滴加鏈霉親和素-過氧化酶溶液孵育。次日DAB 顯色液顯色，蘇木精染液復(fù)染，中性樹脂膠固封；PBS 作為一抗陰性對照組，陽性細(xì)胞著色為棕黃色。

1.3.2 MTT 增殖實驗 調(diào)整MG-63 細(xì)胞數(shù)4×105個/孔，對照組細(xì)胞直接鋪板，實驗組PI3K 抑制劑CAL-101（2.5 nm）處理骨肉瘤MG-63，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入20 μL 的MTT，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)避光孵育4 h，室溫于搖床震蕩10 min。酶標(biāo)儀490 nm 波長測出同一時間點(diǎn)OD 值，用OD 值進(jìn)行細(xì)胞增殖影響的分析。

1.3.3 克隆形成實驗 將對數(shù)生長期MG-63 細(xì)胞消化，調(diào)整密度為300 個/孔，對照組細(xì)胞直接鋪板，實驗組PI3K 抑制劑CAL-101（2.5 nm）處理骨肉瘤MG-63，培養(yǎng)48 h 接種至6 孔板，每孔加2 mL 的10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液。細(xì)胞接種5 d 后每孔各加500 μL 胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。貼壁生長15 d 后，PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，PBS 輕輕沖洗細(xì)胞，室溫風(fēng)干后計數(shù)多于50 個細(xì)胞的克隆。

1.3.4 qRT-PCR MG-63 細(xì)胞數(shù)4×105個/孔，對照組細(xì)胞直接鋪板，實驗組PI3K 抑制劑CAL-101（2.5 nm）處理骨肉瘤MG-63，培養(yǎng)箱設(shè)定37℃、5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞，36 h 后收集細(xì)胞，向細(xì)胞中加入1 mL Trizol試劑以提取總RNA，嚴(yán)格按照PrimeScriptTMRT 試劑盒的說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后加引物和SYBR Green。PCR 反應(yīng)條件：在95℃下進(jìn)行40 個循環(huán)5 s，在95℃下變性10 s，在60℃下退火20 s，在72℃下延伸15 s。每個樣本提供3 個重復(fù)的孔。使用Actin 作為參考標(biāo)準(zhǔn)，使用2-ΔΔCt計算mRNA 的相對表達(dá)水平。引物序列如下，Actin：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′；PI3K：5′-ATCCTTTCCCGCGACACCCGAT-3′，5′-TCCCAGGCGTAGACCAA-3′；p-Smad7：5′-AGCCAATT-TTAACTGAGGAGT-3′，5′-GGCAAGTTGATTGGAGG-GA-3′。

1.3.5 Western blot 調(diào)整MG-63 細(xì)胞數(shù)4×105個/孔，對照組細(xì)胞直接鋪板，實驗組PI3K 抑制劑CAL-101（2.5 nm）處理骨肉瘤MG-63，培養(yǎng)箱設(shè)定37℃、5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞，36 h 后收集細(xì)胞，PBS 洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min 后高速離心（13 000 r/min，離心半徑30 cm）吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE 電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，轉(zhuǎn)膜成功后用脫脂牛奶進(jìn)行封閉，PBST 清洗，均為1∶1000 稀釋Actin、PI3K 及p-Smad7，室溫孵育1 h 后4℃過夜。次日反復(fù)清洗條帶，加兔二抗室溫孵育90 min，PBS 反復(fù)沖洗，發(fā)光拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0 軟件進(jìn)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色檢測PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤組織和正常組織中的表達(dá)

骨肉瘤組織中PI3K 及p-Smad7 的表達(dá)顯著高于正常組織，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖1（封三）。

圖1 免疫組化染色檢測PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤組織和正常組織中的表達(dá)（見內(nèi)文第9 頁）

2.2 PI3K 抑制劑CAL-101 對MG-63 細(xì)胞增殖能力的影響

給藥處理48、72 h 后，實驗組的MG-63 細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 PI3K 抑制劑CAL-101 對MG-63 細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 PI3K 抑制劑CAL-101 對MG-63 細(xì)胞克隆形成能力的影響

給藥處理48 h，繼續(xù)培養(yǎng)15 d 后，實驗組的MG-63細(xì)胞克隆形成能力明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3。

2.4 PI3K 抑 制 劑CAL-101 對MG-63 細(xì) 胞PI3K 及p-Smad7 表達(dá)的影響

給藥處理36 h 后，實驗組的MG-63 細(xì)胞PI3K及p-Smad7 表達(dá)均明顯低于對照組，且p-Smad7 隨著PI3K 被抑制而顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖4。

3 討論

骨肉瘤是骨科最常見的腫瘤之一，由于惡性骨腫瘤治療效果差，5 年存活率僅為20%[6]。骨肉瘤具有侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、治療效果差等特性，導(dǎo)致其治療難度增加。近些年研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/p-Smad7 信號通路與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，因此其備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[7-8]。

圖3 PI3K 抑制劑CAL-101 對MG-63 細(xì)胞克隆形成能力的影響

PI3K 是PI3K/p-Smad7 信號傳導(dǎo)通路中的主要調(diào)節(jié)蛋白，PI3K 已經(jīng)被證實為一種促癌基因，是通過原位雜交技術(shù)在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，其具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重生物活性，可以活化AKT，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和轉(zhuǎn)移等一系列生物學(xué)行為[9-10]。p-Smad7 是TGF-β 信號通路的負(fù)調(diào)控蛋白，在肝癌中p-Smad7 可以促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[11]。最近的幾項研究表明，p-Smad7/PI3K 信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)增高，同時p-Smad7表達(dá)也在增高，其可以激活下游分子Twist 結(jié)合導(dǎo)致癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增加[14-15]。有研究證明，p-Smad7/PI3K 信號通路通過上調(diào)N-cadherin 誘導(dǎo)連環(huán)蛋白基因和抑制E-cadherin 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲[16]。p-Smad7/PI3K 信號通路通過促進(jìn)N-cadherin 翻譯間接上調(diào)其下游效應(yīng)基質(zhì)金屬蛋白酶9，從而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[17-19]。研究表明，p-Smad7/PI3K 信號通路在腫瘤遷移和侵襲以及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[20-21]。但p-Smad7/PI3K 信號通路對骨肉瘤的影響及對骨肉瘤細(xì)胞增殖能力影響如何尚不完全明確。

圖4 PI3K 抑制劑CAL-101 對MG-63 細(xì)胞PI3K 及p-Smad7 表達(dá)的影響

本研究結(jié)果顯示，PI3K 及p-Smad7 表達(dá)在骨肉瘤患者癌組織中的表達(dá)高于正常組織，提示骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展與PI3K/p-Smad7 信號通路表達(dá)有密切的關(guān)系。體外細(xì)胞實驗表明，PI3K 抑制劑CAL-101 能夠抑制骨肉瘤MG-63 細(xì)胞的增殖能力，與腫瘤組織中PI3K 及p-Smad7 表達(dá)檢測結(jié)果一致，說明PI3K/p-Smad7 信號通路激活促進(jìn)了骨肉瘤的增殖能力。此外，PI3K 抑制劑CAL-101 給藥處理后MG-63 細(xì)胞PI3K 及p-Smad7 表達(dá)變化均顯著降低，提示PI3K/p-Smad7 激活可以增強(qiáng)骨肉瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和形成遠(yuǎn)端病灶。

綜上所述，PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤中的表達(dá)異常增高，從而促進(jìn)骨肉瘤形成轉(zhuǎn)移病灶。而PI3K/p-Smad7 信號通路上游如何，其如何來調(diào)控PI3K/p-Smad7 信號通路，均有待于進(jìn)一步研究證實。