萬俊鋒 陽 波 鄭佳狀 冉茂波 宋昭君

四川省遂寧市中心醫(yī)院骨科，四川遂寧 629000

細胞外基質蛋白合成的減少以及降解的增加是椎間盤退變的主要特征，這種分解代謝平衡的破壞進一步引起椎間盤組織結構的變化，最終導致椎間盤無法承受生理載荷，失去應有的穩(wěn)定性，從而導致患者發(fā)生脊柱退行性改變[1-3]。因此找到合適的治療方式抑制髓核細胞外基質的降解，從而延緩椎間盤退變已成為目前的研究熱點。

姜黃素（Curcumin）是一種在我國種植的草本植物，許多研究[4-7]表明，姜黃素具有抗炎、抗凋亡和抗氧化應激等作用。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過激活ERK通路促進軟骨細胞的自噬從而抑制其凋亡[8]，以及姜黃素可以通過抑制NF-κB 通路從而提高軟骨細胞外基質Ⅱ型膠原的合成和降低基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）的表達[9]。但是姜黃素在椎間盤中的作用目前還很少研究，因此本實驗初步探討姜黃素對人椎間盤髓核細胞退變和自噬的相關研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人椎間盤髓核組織取自遂寧市中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）骨科收治的椎間盤突出的7 例患者，男4 例，年齡56～78 歲，女3 例，年齡61～76 歲。與患者及家屬簽訂知情同意書，并獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準。按照Pfirrmann 等[10]的分級標準對所獲得的椎間盤組織進行分級，為Ⅳ～Ⅴ級。排除惡性腫瘤和神經系統(tǒng)病史，術后病理檢查結果均為退變的椎間盤組織。四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；姜黃素、微管相關蛋白3（LC3）B抗體和Beclin 1 抗體均購自美國Sigma 公司；GFPLC3 腺病毒購自上海漢恒生物科技有限公司；MMP-3和MMP-13 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；聚集蛋白聚糖（aggrecan）抗體、β-actin 抗體和二抗均購自武漢博士德公司；膠原蛋白（Collagen）Ⅱ抗體購自美國SAB 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 髓核細胞的提取和培養(yǎng) 將獲得的椎間盤組織用無菌PBS 液反復清洗數(shù)次，用剪刀把髓核組織剪成小的組織粒，置于含0.25%胰酶的離心管中消化1 h，然后離心取沉淀，置于含Ⅱ型膠原酶的離心管中消化4 h，用200 目濾網過濾，收集的細胞置于含20%胎牛血清的F12：DMEM 培養(yǎng)瓶中，放入37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 天更換培養(yǎng)液，1∶2 傳代。

1.2.2 MTT 檢測 選擇在對數(shù)期生長的髓核細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，調整細胞濃度為1×105/mL，接種于96 孔板中，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)待細胞長到80%左右進行藥物處理。對照組只加培養(yǎng)基，白細胞介素-1β（IL-1β）組給予10 ng/mL 處理，而不同濃度的姜黃素處理組給予10、20、40、80、100、150 μmol/L的姜黃素處理，每組設3 個復孔。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入MTT 20 μL 后放入37℃5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，每孔加入DMSO 100 μL，最后在酶標儀490 nm 檢測每孔光度值。

1.2.3 GFP-LC3 轉染觀察 各組細胞更換培養(yǎng)基，用PBS 清洗，向每個培養(yǎng)皿中加入1 mL 培養(yǎng)基和1.5 μL GFP-LC3 腺病毒，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后棄掉培養(yǎng)基，分別給予各實驗組對應的藥物處理，作用24 h 后，吸盡培養(yǎng)液，PBS 清洗，固定液固定15 min，PBS 液清洗，加入DAPI，37 ℃染色10 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4 Western blot 檢測 向各細胞瓶內加入一定量的裂解液，置于冰上裂解30 min 后用細胞刮收集細胞蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，加入buffer 后加熱10 min 變性，配膠進行SDS-PAGE電泳2 h，然后在250 mA 恒定電流條件下進行轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入稀釋的一抗，放入4℃過夜，加入稀釋的二抗，室溫搖床上2 h，ECL 化學發(fā)光。所有實驗均獨立重復3 次。

1.2.5 RT-PCR 檢測 各組細胞處理后分別進行RNA提取，用Trizol 對各組細胞裂解提取總RNA，取2 μL總RNA 按照逆轉錄試劑盒說明合成cDNA 并進行擴增。MMP-3 引物序列：上游5′-ATTCCATGGAGCCAGGCTTTC-3′，下游5′-CATTTGG-GTCAAACTCCAACTGTG-3′；MMP-13 引物序列：上游5′-TTGATGATGATGAAACCTGGACAAG-3′，下游5′-TTGCCGGTGTAGGTGTAGATAGGAA-3′；Collagen Ⅱ引物序列：上游5′-CAGGTGAACCTGGACGAGAG-3′，下游5′-CCCACAGCACCAGTCTCAC-3′；Aggrecan 引物序列：上游5′-CTACCAGTGGATCGGCCTGAA-3′，下游5′-CGTGCCAGATCATCACCACA-3′；GAPDH 引物序列：上游5′-GCAC-CGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-TGG-TGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR 反應體系為50 μL，PCR 反應條件：95℃30 s，60℃30 s，共循環(huán)40 次，95℃10 s，65℃5 s 進行溶解分析。以GAPDH 為內參照標化各組cDNA 模板，目的基因的表達值采用2-ΔΔCt法計算。所有實驗均獨立重復3 次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT 檢測姜黃素對髓核細胞活性的影響

MTT 檢測結果發(fā)現(xiàn)當姜黃素濃度為100、150、200 μmol/L 時，能夠顯著的抑制髓核細胞的活性（P ＜0.05），而姜黃素濃度為10、20、40、80 μmol/L 時對髓核細胞的生長活性沒有顯著影響（P ＞0.05）。因此考慮到以不影響髓核細胞活性的情況下盡可能地發(fā)揮姜黃素的作用，選擇姜黃素濃度為80 μmol/L 進行后續(xù)的實驗。見圖1。

圖1 MTT 檢測姜黃素對髓核細胞活性的影響

2.2 RT-PCR 檢測姜黃素對髓核細胞退變mRNA 水平的影響

RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)與對照組比較，IL-1β 顯著降低Collagen Ⅱ和aggrecan mRNA 的表達，增加MMP-3和MMP-13 mRNA 的表達（P ＜0.05）。而與IL-1β 組比較，姜黃素處理后明顯地提高Collagen Ⅱ和aggrecan mRNA 的表達，降低MMP-3 和MMP-13 mRNA 的表達（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 RT-PCR 檢測姜黃素對髓核細胞退變mRNA 水平的影響

2.3 Western blot 檢測姜黃素對髓核細胞退變蛋白水平的影響

Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)與對照組比較，IL-1β 顯著降低Collagen Ⅱ和aggrecan 蛋白的表達，增加MMP-3和MMP-13 蛋白的表達（P ＜0.05）。而與IL-1β 組比較，姜黃素處理后明顯提高了Collagen Ⅱ和aggrecan蛋白的表達，降低MMP-3 和MMP-13 蛋白的表達（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 Western blot 檢測姜黃素對髓核細胞退變蛋白水平的影響

2.4 姜黃素促進GFP-LC3 腺病毒轉染的髓核細胞自噬顆粒的增多

通過GFP-LC3 腺病毒轉染髓核細胞后，觀察發(fā)現(xiàn)對照組和IL-1β 組髓核細胞內自噬顆粒數(shù)很少，而姜黃素處理后髓核細胞內的自噬顆粒數(shù)明顯增多。見圖4（封三）。

圖4 GFP-LC3 腺病毒轉染后觀察髓核細胞內自噬情況（800×）（見內文第13 頁）

2.5 姜黃素能明顯促進髓核細胞自噬蛋白的表達

Western blot 結果顯示對照組和IL-1β 處理組髓核細胞內自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin 1 水平較低，而姜黃素處理后髓核細胞內的自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin 1水平明顯增加（P ＜0.05）。見圖5。

圖5 Western blot 檢測姜黃素對髓核細胞自噬蛋白的表達

3 討論

髓核細胞外基質的改變被認為是椎間盤退行性改變的主要問題。細胞外基質的主要成分是Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖，在退變椎間盤中表達下降。同時細胞外基質中分解代謝蛋白酶如基質金屬蛋白酶在椎間盤退變中上調，這是椎間盤退變中細胞外基質降解的主要原因[11-13]。研究[14]表明，IL-1β 能直接抑制椎間盤細胞外基質的合成和增加MMP 的表達，同時本研究也提示IL-1β 處理髓核細胞后能夠抑制aggrecan 和CollagenⅡ的表達和MMP-3 和MMP-13 的表達，所以使用IL-1β 處理髓核細胞。

姜黃素在治療許多疾病包括阿爾茨海默病，骨關節(jié)炎等方面有一定療效[15-16]。研究[17]報道，姜黃素能夠抑制軟骨細胞基質的降解和促進其合成。但在椎間盤中的報道卻很少，本研究發(fā)現(xiàn)當用姜黃素處理IL-1β誘導的髓核細胞后，髓核中Collagen Ⅱ和aggrecan的表達明顯增多，而MMP-3 和MMP-13 表達明顯下降，表明姜黃素能夠減緩椎間盤的退變，但是其具體分子機制還不是很清楚。

自噬是一種自我保護的方式，通過將細胞受損蛋白質和細胞器降解，以維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定，在人類退行性疾病中被廣泛研究[18-19]。研究[20]表明自噬對軟骨細胞和椎間盤的退行性過程有保護作用。姜黃素能通過促進自噬抑制軟骨細胞的凋亡[8]。但是姜黃素對椎間盤的保護作用是否與自噬相關還不是很清楚，本研究結果提示，當給予姜黃素處理IL-1β 誘導的髓核細胞后自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin 1 水平明顯增加，同時GFP-LC3 腺病毒轉染后也發(fā)現(xiàn)姜黃素處理后髓核細胞內的自噬顆粒數(shù)明顯增多。

綜上所述，姜黃素能夠減緩椎間盤的退變，其可能的機制是姜黃素促進髓核細胞的自噬，但是其進一步的分子機制還有待繼續(xù)研究。