潘霞 胡盈盈 陳澤宇

摘 要：以浙江省磐安浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）為研究對(duì)象，利用PCR-DGGE技術(shù)，研究連作對(duì)浙貝母根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，連作條件下浙貝母根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為細(xì)菌種群數(shù)量顯著減少;但連作年限對(duì)浙貝母根際土壤細(xì)菌多樣性的影響較小，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化不明顯。對(duì)浙貝母根際土壤細(xì)菌種群的DGGE電泳結(jié)果進(jìn)行主成分分析，分析結(jié)果顯示，所取浙貝母土壤樣品的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群為蠟樣芽胞桿菌群（Bacillus cereus.Frankland）、芽胞桿菌屬（Bacillus Cohn）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）。綜上表明，浙貝母連作后根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的改變可能是導(dǎo)致浙貝母連作障礙產(chǎn)生的重要原因之一。

關(guān)鍵詞：浙貝母;連作;根際土壤;細(xì)菌群落

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料.浙貝母根際土壤樣品采自浙江省磐安塘下村種植大田。土壤以紅壤為主，浙貝母種植基本為連作種植，除連作年限外土壤處理背景一致。取浙貝母未連作土壤、連作2年土壤、連作多年根際土壤樣品。

2.研究方法

（1）取樣方法，去除2～3 cm的表層土，完整挖出浙貝母的全部根系，將大塊土抖落，取附著在根系上的細(xì)土至干凈的取樣袋中，不同連作年限的浙貝母根際土壤各取三份作為實(shí)驗(yàn)組，取未連作土壤三份作為對(duì)照。采樣后密封保存在4℃冰箱中。

（2）土壤DNA的提取純化，釆用OMEGA的E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒提取浙貝母根際土壤的微生物總DNA。

（3）16S rDNA V3 片段 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增目的DNA為細(xì)菌16S部分核糖體核苷酸序列。PCR程序模式為touchdown-PCR程序。反應(yīng)總體系為ddH2O 17 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Primer 534 1 μL，Primer 341-GC 1 μL，Ex Tag酶0.5 μL和DNA模板1 μL。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。

（4）變性梯度凝膠電泳，配置高低兩種濃度的凝膠溶液，加入40 μL 10%過硫酸銨與10 μL TEMED，并迅速渦旋注入連通柱。打開連通閥并運(yùn)轉(zhuǎn)蠕動(dòng)泵，轉(zhuǎn)速為15 rpm。待凝膠溶液注入玻板指定高度后，將泵管置于廢液缸，立即往灌膠器中注滿MQ，開始清洗。

在電泳槽中注入1×TAE緩沖液。放入加熱罩后設(shè)置緩沖液加熱溫度為65℃。待膠凝固，往玻璃板中插入樣梳，并使之傾斜，用移液槍灌注上層膠，加入4 mL后，將樣梳擺正。待膠凝固，拔出樣梳，用1×TAE清洗。每個(gè)點(diǎn)樣孔上樣液為PCR產(chǎn)物15 μL、3×loading buffer 7.5 μL。將電泳液溫度設(shè)置為60℃，電泳為50 V，13 h。當(dāng)電泳結(jié)束，切去上層膠，并在上樣端切角標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)采用銀染法進(jìn)行染膠。染色結(jié)束后用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)對(duì)觀察到的結(jié)果進(jìn)行拍照，最后用Bio-Rad Quantity One軟件對(duì)DGGE條帶進(jìn)行分析。

（5）割膠回收與克隆測序。挑選DGGE電泳膠上的優(yōu)勢(shì)條帶并進(jìn)行割膠回收，之后進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物用pMD-18-T載體進(jìn)行克隆。選取較亮的PCR條帶所代表的菌液作為測序菌液進(jìn)行分裝，送至上海生工公司進(jìn)行測序。

二、結(jié)果與分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DGGE檢測后獲得多條清晰條帶。條帶隨著連作年限增加亮度降低，連作多年的浙貝母土壤樣品較連作兩年的DGGE條帶亮度變化較小，個(gè)別條帶在亮度上有差別。從條帶數(shù)量上看，隨著連作年限增加，DGGE條帶數(shù)目逐漸減少。同樣，連作多年的土壤樣品較連作兩年的土壤樣品DGGE條帶數(shù)量變化不明顯。DGGE電泳條帶數(shù)可以近似認(rèn)為是細(xì)菌種群的數(shù)量，而條帶的亮度則反映了該種細(xì)菌數(shù)量的多少[8]。據(jù)此初步推斷，連作導(dǎo)致浙貝母根際土壤細(xì)菌種群的數(shù)量減少，影響了根際土壤中細(xì)菌群落的組成。

通過測序結(jié)果可知，浙貝母連作兩年與連作多年土壤樣品中細(xì)菌種群數(shù)較未連作土壤樣品中細(xì)菌種群數(shù)顯著減少。但連作多年土壤樣品中細(xì)菌種群數(shù)量和連作兩年土壤樣品中細(xì)菌種群數(shù)量無明顯差別。隨著連作年限的增加，個(gè)別種群的細(xì)菌數(shù)量也逐漸減少，可以從同一層次的條帶亮度逐漸降低看出。連作兩年的土壤樣品中，條帶1B、2B、3B和9B特別亮，經(jīng)序列分析，推斷其為蠟樣芽胞桿菌群、芽胞桿菌屬及鞘氨醇單胞菌屬，相似菌株最大相似度分別為99%、99%和100%。連作多年的土壤樣品中，上述菌數(shù)量減少，其條帶亮度降低。據(jù)此推斷，在連作條件下，浙貝母根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，土壤微生態(tài)環(huán)境改變，影響了浙貝母的生長。而土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的改變，與連作障礙有著密不可分的關(guān)系。

3 討論

在連作情況下，浙貝母根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)低于未連作狀態(tài)，隨著連作年限增長，細(xì)菌種群數(shù)量減少并不明顯。對(duì)根際土壤細(xì)菌群落的DGGE結(jié)果進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，連作后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成有明顯變化，土壤中優(yōu)勢(shì)種群為蠟樣芽胞桿菌群、芽胞桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。研究發(fā)現(xiàn)，作物連作后對(duì)土壤根際微生物的生長繁殖具有選擇性，能夠促進(jìn)或抑制某些微生物生長，進(jìn)而改變微生物種群的多樣性。根際土壤微生物功能的差異會(huì)影響植物所需營養(yǎng)物質(zhì)的提供[9]，而植物對(duì)土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的選擇，可能是導(dǎo)致連作障礙產(chǎn)生的原因。

由以上討論可知，連作后浙貝母根際土壤細(xì)菌群落組成及功能的改變，使得浙貝母根際土壤微生態(tài)環(huán)境發(fā)生了變化，這與浙貝母連作障礙相關(guān)。但連作后浙貝母根際微生物群落除了上述菌落外，其結(jié)構(gòu)組成中還有哪些菌群發(fā)生了比較大的改變，以及它們與浙貝母連作障礙的機(jī)理關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]張明發(fā)，沈雅琴.浙貝母藥理研究進(jìn)展[J].上海醫(yī)藥，2007.28（10）：459-461.

[2]中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1959，148-152.

[3]趙鸝.麗水市浙貝母產(chǎn)業(yè)化發(fā)展策略與規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)研究[D].浙江杭州：浙江大學(xué)，2004.

（作者單位：浙江師范大學(xué)，化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院）