李 健，趙志付，吳志奎，郭建友，張 成，趙 鵬，原 晨，柳紅良

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053； 2. 中國科學(xué)院心理研究所，北京 100101； 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700； 4. 北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院，北京 101300)

中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院趙志付教授根據(jù)《周易》及《黃帝內(nèi)經(jīng)》(以下簡稱《內(nèi)經(jīng)》)中關(guān)于人體剛?cè)嵝纳砝碚?，繼承導(dǎo)師歐陽琦教授、董建華教授的學(xué)術(shù)思想和學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合數(shù)十年的臨床體會(huì)，創(chuàng)立了中醫(yī)心身醫(yī)學(xué)剛?cè)岜孀C方法，指導(dǎo)心身疾病的臨床治療，療效顯著[1-2]。剛?cè)岜孀C可分兩綱四型十六證，其中首分剛證與柔證。進(jìn)行中醫(yī)心身醫(yī)學(xué)剛?cè)岜孀C的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究時(shí)需從心身的角度入手，所以采用國際上通用的行為學(xué)檢測方法[3]，對(duì)各種心身剛?cè)嶙C造模方法進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，將最符合剛?cè)嶙C核心癥狀的模型作為本實(shí)驗(yàn)后繼實(shí)驗(yàn)的造模方法。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用SPF級(jí)成年雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠128只，體質(zhì)量(200±20) g，購自北京維通利華有限公司(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK 2009-0007)。

1.2 主要試劑及儀器

蔗糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分子量342.29(批號(hào)0091304)；睡眠剝奪箱：體積為 50 cm×30 cm×30 cm 的塑料水槽自制而成；JY-1001型電子天平；曠場實(shí)驗(yàn)圓箱(自制)：規(guī)格為半徑100 cm、高75 cm，將箱內(nèi)涂為黑色；DMS-2 Morris水迷宮系統(tǒng)：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

將SD雄鼠40只，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組(簡稱對(duì)照組)、剛證打斗組(簡稱打斗組)、剛證睡眠剝奪組(簡稱睡眠剝奪組)、柔證束縛組(簡稱束縛組)、柔證長期慢性應(yīng)激組(簡稱長期慢性應(yīng)激組)各8只大鼠。

2.2 處理方法[3-6]

實(shí)驗(yàn)前在中國科學(xué)院心理所動(dòng)物房內(nèi)合籠飼7 d，每籠3只，鼠籠體積 (70×50×50 cm)。自由飲食，光/暗周期為12 h/12 h(光照時(shí)間6∶00～18∶:00)，背景噪音(40±10)db，溫度(20 ℃±3℃)。實(shí)驗(yàn)1中對(duì)照組：正常喂養(yǎng)、不孤養(yǎng)，2只大鼠同籠，每日灌服蒸餾水4.5 ml/kg，從造模第1天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束連續(xù)21 d。剛證睡眠剝奪組：不孤養(yǎng)，每日灌服蒸餾水4.5 ml/kg，從造模第1天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束應(yīng)用小站臺(tái)水環(huán)境技術(shù)進(jìn)行48 h睡眠剝奪，干預(yù)過程中大鼠可自由飲水，每天喂食30 min。剛證打斗組：采用改良孤養(yǎng)社會(huì)失敗造模方法，每日灌服蒸餾水4.5 ml/kg，從造模第1天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束孤養(yǎng)，每天固定時(shí)間將同組任意2只大鼠放于同一個(gè)籠子使其相互打斗，每次打斗5 min，每天上午和下午各打斗1次，每日2次，造模過程持續(xù)14 d。柔證束縛組：不孤養(yǎng)，每日灌服蒸餾水4.5 ml/kg，從造模第1天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束每天用布袋包裹全身束縛5 min，每次用塑料夾夾大鼠鼠尾根部2 min，干預(yù)持續(xù)14 d。柔證長期慢性應(yīng)激組：孤養(yǎng)，從造模第1天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每日灌服蒸餾水4.5 ml/kg，進(jìn)行慢性不可預(yù)知應(yīng)激造模21 d。具體程序如下：1st week；夾尾30 s；游泳(常溫23 ℃)：15 min；夾尾1 min；游泳(冷水12 ℃)：5 min；徹夜光照；無造模禁食禁水：24 h；2nd week；游泳(冷水12 ℃)：5 min；夾尾90 s；游泳(常溫23 ℃)：10 min；游泳(冷水12 ℃)：5 min；徹夜光照；禁食禁水24 h；無造模；3rd week；徹夜光照；游泳(常溫23 ℃)：15 min；徹夜光照；夾尾60 s；游泳(冷水12 ℃)5 min；禁食禁水；無造模。

2.3 行為學(xué)檢測

分別于第1天及實(shí)驗(yàn)造模末日行大鼠體質(zhì)量測量、十字高架迷宮測試、曠場測試、糖水偏愛度檢測、攻擊行為檢測。

2.3.1 測量大鼠體質(zhì)量 分別于第1、7、14、21天對(duì)各組大鼠體質(zhì)量進(jìn)行測量。

2.3.2 高架十字迷宮測試 迷宮內(nèi)壁及底面為黑色，距地面高度為100 cm，由2條開放臂、2條封閉臂、1個(gè)中央?yún)^(qū)平臺(tái)組成呈十字形。各組干預(yù)結(jié)束后，在安靜、四周由遮光簾隔離干擾的環(huán)境條件下進(jìn)行。所有動(dòng)物均提前10 min進(jìn)入測試實(shí)驗(yàn)室。高架十字迷宮測試時(shí)將大鼠迅速置于高架十字迷宮的中央平臺(tái)處，使其頭部正對(duì)其中任一開放臂，釋放后即開始測試并同步錄像，每只大鼠觀察5 min。觀測完畢后用低濃度酒精擦拭清理。記錄指標(biāo)包括大鼠進(jìn)入開放臂、封閉臂次數(shù)及累積時(shí)間。

2.3.3 曠場試驗(yàn) 自制鐵質(zhì)圓形曠場箱半徑為100 cm，高為50 cm。內(nèi)側(cè)壁及底面為黑色，正上方安置攝像頭。于造模結(jié)束第2天的上午8時(shí)開始，在安靜、四周由全封閉遮光簾隔離干擾并杜絕參照物。測試前先置大鼠于測試實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)5 min。研究人員將大鼠輕放入曠場箱中央，開始觀察并同步錄像。5 min后取出大鼠，用蘸有低濃度酒精的毛巾擦拭箱底并清掃鼠便，待氣味消散則開始下一只大鼠的測試。觀察指標(biāo)有5 min運(yùn)動(dòng)總路程。

2.3.4 糖水偏愛度測試 分別在第1天與造模完成后進(jìn)行糖水試驗(yàn)。測試前進(jìn)行24 h禁食禁水，測試時(shí)給予大鼠定量好的兩瓶水， 一瓶純水，一瓶l%蔗糖水，240 min后取走2瓶水分別定量。根據(jù)動(dòng)物的總液體消耗、糖水消耗和純水消耗計(jì)算大鼠糖水偏愛度。

2.3.5 攻擊行為測定 自制玻璃箱長寬高為50 cm×30 cm×30 cm，正上方安置攝像頭。于造模結(jié)束第2天在安靜、四周由全封閉的遮光簾隔離光線和其他環(huán)境干擾。實(shí)驗(yàn)前先置待測大鼠于測試實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)10 min。用筆標(biāo)記其中一只大鼠，研究者將2只大鼠同時(shí)輕放入自制玻璃箱內(nèi)，開始錄像8 min。大鼠測試完畢后用低濃度酒精擦拭。通過影像資料計(jì)算大鼠8 min內(nèi)行為時(shí)間，其中包括有嗅探、梳理皮毛、協(xié)助梳理皮毛、跟隨等行為，各種行為可分為攻擊性社交行為以及非攻擊性社交行為。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量變化

表1顯示，各組動(dòng)物在造模前體質(zhì)量基線及造模第7天組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模第14、21天與對(duì)照組比較，CUMS組大鼠體質(zhì)量增長緩慢(P<0.05，P<0.01)。睡眠剝奪組第2天與第1天的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 各組大鼠EPM試驗(yàn)和OF試驗(yàn)結(jié)果

表2顯示，各組動(dòng)物在造模后與對(duì)照組比較，打斗組、睡眠剝奪組及長期慢性應(yīng)激組在高架十字迷宮試驗(yàn)中的開臂時(shí)間百分比顯著下降(P<0.05)，打斗組和睡眠剝奪組大鼠OF試驗(yàn)總路程顯著升高(P<0.05)，打斗組活動(dòng)距離高于睡眠剝奪組(P<0.05)；與對(duì)照組比較，CUMS組大鼠總路程下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況比較(g)

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

表2 各組大鼠十字高架試驗(yàn)和曠場試驗(yàn)結(jié)果比較

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與睡眠剝奪組比較：#P<0.05

3.3 各組大鼠糖水試驗(yàn)結(jié)果

表3顯示，各組動(dòng)物在造模前糖水偏愛度基線組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，造模完成后與對(duì)照組比較，束縛組及CUMS組糖水偏愛度顯著下降(P<0.05)；其他組和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠糖水試驗(yàn)結(jié)果比較[例(%)]

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05

3.4 各組大鼠攻擊行為測定結(jié)果

表4顯示，造模完成后與對(duì)照組比較，打斗組大鼠的攻擊行為百分比顯著升高(P<0.01)；其他組和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠攻擊行為變化比例

注：與對(duì)照組比較：**P<0.01

3.5 各組檢測指標(biāo)比較

表5顯示，與對(duì)照組比較，其中打斗組OF總路程高于睡眠剝奪組(P<0.05)，CUMS組糖水偏愛度與束縛組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但前者均值低于后者。

4 討論

剛?cè)岜孀C為趙志付通過40余年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)和相關(guān)文獻(xiàn)分析[1-2]，以國家中醫(yī)藥管理局課題“剛?cè)嶙C治的中醫(yī)內(nèi)科心身疾病學(xué)研究”研究結(jié)果為基礎(chǔ)提出的中醫(yī)心身醫(yī)學(xué)辨證理論。其首分剛?cè)醿删V，柔證是一組以情志抑郁、對(duì)獎(jiǎng)賞的反應(yīng)性下降為核心癥狀的證候。目前大多實(shí)驗(yàn)均采用糖水液體消耗試驗(yàn)作為抑郁動(dòng)物模型建模是否成功的重要指標(biāo)。本研究CUMS組與束縛組均能降低大鼠糖水偏愛度，其中長期慢性應(yīng)激組大鼠的糖水偏愛度明顯低于束縛組，故而考慮CUMS造模方法能更好地體現(xiàn)柔證的核心癥狀。此外，長期慢性應(yīng)激組大鼠在體質(zhì)量、高架十字迷宮開臂時(shí)間百分比、曠場試驗(yàn)總路程方面均較對(duì)照組有明顯下降，表明該組大鼠存在對(duì)新事物的好奇和探索能愿的下降，這也符合柔證臨床表現(xiàn)，故而將CUMS作為柔證的造模方法。剛證核心癥狀是“心煩、易怒”即具有較強(qiáng)的攻擊性。本研究中惟有打斗組大鼠攻擊行為比例較對(duì)照組明顯升高。此外，曠場試驗(yàn)中打斗組與睡眠剝奪組中活動(dòng)總路程明顯升高，其中打斗組總路程明顯高于睡眠剝奪組，一方面可能是因?yàn)閼?yīng)激干預(yù)時(shí)間的長短導(dǎo)致其不同，另一方面也說明打斗組能使大鼠形成更為明顯的主動(dòng)活動(dòng)趨勢，所以考慮各方面結(jié)果，本研究決定以打斗組干預(yù)方法作為剛證模型的造模方法。

表5 各組檢測指標(biāo)比較

注：表中↓表示與對(duì)照組比較降低，差異具有顯著性；表中↑表示與對(duì)照組比較升高，差異具有顯著性

長期慢性應(yīng)激組采用CUMS造模方法是國際公認(rèn)常用抑郁樣行為造模方法，該模型動(dòng)物表現(xiàn)與人類因中長期慢性低水平刺激所導(dǎo)致的抑郁狀態(tài)表現(xiàn)接近。打斗組采用改良孤養(yǎng)社會(huì)失敗造模方法，該方法為國內(nèi)外常用應(yīng)激造模方法，是從社會(huì)應(yīng)激角度模擬人類心身疾病的病理生理過程。采用這2種模型能保證其學(xué)術(shù)公認(rèn)性和可行性，但作為中醫(yī)剛?cè)嶙C動(dòng)物模型仍需要從中醫(yī)病機(jī)和證候?qū)?yīng)藥物干預(yù)行為學(xué)改變2 個(gè)方面進(jìn)行研究以驗(yàn)證其可靠性。

5 結(jié)語

本研究評(píng)估4種候選公認(rèn)心身大鼠模型行為學(xué)表現(xiàn)，結(jié)合中醫(yī)剛?cè)岜孀C理論核心癥狀，初擬以改良孤養(yǎng)社會(huì)失敗造模法為剛證造模方法；CUMS造模法為柔證造模方法。中醫(yī)剛?cè)岜孀C理論具有心身二元的特點(diǎn)，本研究尚屬剛?cè)嶙C大鼠模型的初步研究階段，需要從剛?cè)嶙C核心病機(jī)、模型可重復(fù)性等角度進(jìn)一步研究，以明確該模型的可靠性，從而為該理論提供客觀的科學(xué)依據(jù)。