杜 萍，曹天旭，2**，崔寶凱

（1.長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 408100；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌 330045；3.北京林業(yè)大學(xué)微生物研究所，北京 100083）

毛尖蘑 [Lyophyllum fumosum(Pers.)P.D.Orton]，別名金子蘑、仙蘑菇，是一種極為罕見的野生珍稀食（藥） 用真菌。在分類學(xué)上屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 離褶傘科 （Tricholomataceae） 離褶傘屬（Lyophyllum）[1-3]。毛尖蘑主要分布于我國黑龍江、吉林、遼寧、河北、青海、甘肅、河南等地[4]。在黑龍江省主要分布在大、小興安嶺一帶。由于生長在金礦開采后的沙灘（毛尖）上，因此得名毛尖蘑。

毛尖蘑色澤黃嫩，營養(yǎng)豐富，菇柄脆嫩爽口，味道清香，尤其干制加工后香氣更加濃郁。其多糖具有抗腫瘤，保肝護(hù)肝，增強(qiáng)免疫力等作用[5]。中醫(yī)認(rèn)為該菇具有補(bǔ)腎、利尿、治腰酸痛、滲濕、健脾、止瀉等功效[5]，是高血壓、心血管和肥胖癥患者的理想食品，市場開發(fā)前景廣闊。

毛尖蘑生長條件苛刻，野生資源已十分有限，因此，實(shí)現(xiàn)人工栽培迫在眉睫。目前為止，毛尖蘑的研究主要集中在菌種分離、菌絲發(fā)酵培養(yǎng)、人工馴化栽培和粗多糖的提取及其功效分析方面[5-10]。鄭稚鶯等[11]利用一定濃度的茶堿在變溫條件下誘導(dǎo)出了毛尖蘑子實(shí)體原基。目前，毛尖蘑因菌絲生長緩慢，導(dǎo)致出現(xiàn)制種成功率低、易污染、出菇遲、產(chǎn)量低等現(xiàn)象，使其仍不能商業(yè)化栽培，且其分類地位尚不清楚。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）是中度保守區(qū)域，種內(nèi)保守性相對(duì)一致，而種間差異較為明顯，這使得ITS應(yīng)用于真菌的分子鑒定及屬內(nèi)種間或種內(nèi)差異比較明顯的菌群之間的系統(tǒng)分析[12]。從黑龍江省大興安嶺漠河采集到毛尖蘑標(biāo)本，經(jīng)子實(shí)體組織分離獲得純菌株，對(duì)其進(jìn)行了ITS序列鑒定和碳源、氮源的篩選試驗(yàn)，旨在明確毛尖蘑的分類地位、篩選菌絲培養(yǎng)適宜的碳源、氮源，為毛尖蘑的人工馴化栽培和藥用價(jià)值開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試標(biāo)本

供試標(biāo)本于2013年8月采集于黑龍江省大興安嶺漠河，樣品編號(hào)為DP20130801。

1.2 子實(shí)體外觀形態(tài)觀察及菌種分離

1.2.1 子實(shí)體外觀形態(tài)觀察

觀察并描述子實(shí)體表面性狀、結(jié)構(gòu)、顏色、質(zhì)地，進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征初步鑒定。

1.2.2 菌種分離

采用子實(shí)體組織分離方法分離菌種，分離培養(yǎng)15 d后，挑取先端菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品rDNA的ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增、測序及比對(duì)分析

1.3.1 樣品基因組DNA提取與檢測

菌絲體培養(yǎng)、收集及DNA提取方法詳見文獻(xiàn)[13]。

1.3.2 樣品rDNA的ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增與測序

采 用 真 菌 通 用 引 物 ITS 5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；ITS 4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，由英駿生物技術(shù)有限公司（invitrogen） 合成。

PCR 擴(kuò)增體系為：10×Buffer 5.0 μL，25 mmol·L-1MgCl24.0 μL，4 mmol·L-1dNTPs 3.0 μL，5 U·μL-1Taq DNA polymerase 0.5 μL，10 μmol·L-1引物各 2.0 μL，模板 DNA 2.0 μL，ddH2O 31.5 μL，反應(yīng)總體積為 50.0 μL。

擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性1 min；94℃變性30 s，60℃退火 1 min，72℃延伸1.5 min，共 30個(gè)循環(huán)；最后于72℃補(bǔ)平8 min，終止溫度為4℃。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物和Marker上樣量均為5 μL，電泳結(jié)果于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像。PCR產(chǎn)物送華大基因（北京）公司測序。

1.3.3 ITS序列比對(duì)和同源性分析

將測序獲得的序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast，分析同源性。當(dāng)物種的rDNA ITS區(qū)序列與比對(duì)的序列同源性≥99%時(shí)為相同種；同源性在95%～99%為相同屬[14]。

1.4 最適碳源、氮源篩選試驗(yàn)

1.4.1 最適碳源篩選

試驗(yàn)碳源：麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖。

無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、蛋白胨2.0 g、瓊脂18.0 g，水1 L。

分別將等量（2%）的麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖，加入到無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，對(duì)毛尖蘑母種培養(yǎng)的碳源進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)，各設(shè)4個(gè)重復(fù)。

1.4.2 最適氮源篩選

試驗(yàn)氮源：牛肉膏、麥麩、硫酸銨、酵母膏、黃豆粉、蛋白胨。

無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、瓊脂18.0 g，水1 L。

分別將等量（0.2%）的牛肉膏、麥麩、硫酸銨、酵母膏、黃豆粉、蛋白胨，加入到無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，對(duì)毛尖蘑母種培養(yǎng)的氮源進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)，各設(shè)4個(gè)重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

菌絲日均生長速度差異顯著性采用SPSS 16.0軟件中Duncan式新復(fù)極差法進(jìn)行分析。菌絲生長速度（V，mm·d-1）公式為：

式中：R表示菌落半徑（mm）；D表示菌絲生長天數(shù) （d）。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實(shí)體形態(tài)觀察

毛尖蘑叢生子實(shí)體如圖1所示。每叢分枝3枚～7枚不等，菌蓋直徑1 cm～7 cm，邊緣稍內(nèi)卷，半球形、扁半球形至平展，初期灰褐色，成熟時(shí)淺黃褐色。表面近平滑，菌肉白色，細(xì)膩，肉厚。菌褶直生或稍延生，密，黃褐至暗褐色。菌柄長4.0 cm～9.0 cm，粗1.0 cm～1.2 cm，基部粗大，頂端稍細(xì)，形似錐把，實(shí)心、質(zhì)脆，往往擠為一堆呈樹樁狀。

圖1 野生毛尖蘑子實(shí)體Fig.1 Fruiting bodies of the wild Lyophyllum fumosum

2.2 測序結(jié)果及其序列分析

本研究分離菌株的ITS序列已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為MG571757，該菌株ITS區(qū)域核酸序列總長為677 bp。將樣品ITS序列輸入NCBI網(wǎng)頁，用Blast進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果有2株核酸序列與其有99%的相似度，因此，鑒定該株野生菌為Lyophyllum fumosum。經(jīng)查閱資料得知學(xué)名為褐離褶傘，別名有白荷葉離褶傘[15]、煙色離褶傘、褐黃離褶傘、毛尖蘑、塊根蘑、賓王菇等[4]。

2.3 不同碳源對(duì)毛尖蘑菌絲生長的影響

菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的生長狀況見圖2、表1。

圖2 褐離褶傘菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的生長情況Fig.2 Mycelia growth situation of Lyophyllum fumosum on different carbon source media

由圖2可知，毛尖蘑菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上均能生長，菌絲白色至米白色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)。由表1可知，培養(yǎng)時(shí)間為28 d的菌絲在可溶性淀粉培養(yǎng)基上日均生長速度最快，菌絲濃密、粗壯，邊緣生長整齊。在P＜0.05水平上，與玉米粉培養(yǎng)基上的菌絲日均生長速度相比差異顯著，與麥芽糖、蔗糖、甘露醇、對(duì)照和葡萄糖培養(yǎng)基上的菌絲日均生長速度相比差異不顯著。而培養(yǎng)時(shí)間為35 d的菌絲，在不同碳源培養(yǎng)基中日均生長速度差異明顯，其中麥芽糖培養(yǎng)基上的菌絲日均生長速度最快，與以可溶性淀粉為碳源的菌絲日均生長速度相比差異不顯著，與其他5種碳源菌絲日均生長速度相比差異顯著；在無碳培養(yǎng)基上菌絲日均生長速度最慢，與除麥芽糖和可溶性淀粉外的其他4種碳源菌絲日均生長速度相比差異不顯著，可見，菌絲培養(yǎng)最后1周生長速度有減慢的趨勢。從2段培養(yǎng)時(shí)間綜合考慮，最終確定毛尖蘑菌絲培養(yǎng)的適宜碳源是可溶性淀粉和麥芽糖。

表1 不同碳源對(duì)褐離褶傘菌絲生長的影響Tab.1 Effect of different carbon sources on the mycelia growth of Lyophyllum fumosum

2.4 不同氮源對(duì)毛尖蘑菌絲生長的影響

菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上的生長狀況見表2、圖3。

表2 不同氮源對(duì)褐離褶傘菌絲生長的影響Tab.2 Effect of different nitrogen sources on the mycelia growth of Lyophyllum fumosum

圖3 褐離褶傘菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上的生長情況Fig.3 Mycelia growth situation of Lyophyllum fumosum on different nitrogen sources media

由圖3可知，毛尖蘑菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上均能生長，除在無氮培養(yǎng)基中有1皿感染雜菌外，其余氮源的各處理均未發(fā)生感染，表明毛尖蘑菌株對(duì)不同氮源的適應(yīng)性較強(qiáng)。由表2可知，在P＜0.05水平上，不同氮源培養(yǎng)的菌絲日均生長速度差異不明顯。其中以黃豆粉為氮源的菌絲日均生長速度最快，與牛肉膏培養(yǎng)基上的菌絲日均生長速度相比差異顯著，與其他5種氮源的日均生長速度相比差異不顯著，但其菌絲較稀疏，邊緣生長不齊；在無氮培養(yǎng)基（CK） 中的菌絲稀疏，生長不齊，長勢很弱。因此，從菌絲長勢和生長速度方面綜合考慮，最終確定蛋白胨、硫酸銨和酵母膏為毛尖蘑菌絲培養(yǎng)的適宜氮源。

3 討論

由于離褶傘屬真菌的各個(gè)種在形態(tài)上并無十分明確的區(qū)別[16]，因而僅通過形態(tài)上的觀察并不能確定其種名。本研究中，采集到的野生毛尖蘑菌株經(jīng)ITS序列分析鑒定為褐離褶傘。

本文中，利用單因子試驗(yàn)篩選出毛尖蘑菌絲生長的適宜碳源為可溶性淀粉和麥芽糖，其中培養(yǎng)時(shí)間為28 d的菌絲，在以蔗糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上，與以可溶性淀粉和麥芽糖為碳源的菌絲日均生長速度相比差異不顯著（P＜0.05），但無論在長勢還是生長速度上都遜色于可溶性淀粉和麥芽糖。梁秀鳳等[8]對(duì)毛尖蘑一級(jí)菌種配方篩選試驗(yàn)表明，蔗糖和麥芽糖可作為碳源交替使用，最佳氮源為酵母膏。鄭秋霞等[1]研究表明暗褐離褶傘菌絲生長的最適碳源是麥芽糖，最適氮源是蛋白胨。周會(huì)明等[17]對(duì)5株荷葉離褶傘的碳氮源篩選表明，有3個(gè)菌株的最適碳源是蔗糖，最適氮源是蛋白胨；另2個(gè)菌株的最適碳源是葡萄糖，最適氮源是蛋白胨。綜上所述，離褶傘屬不同種或同一種的不同菌株[8，17]對(duì)碳源的需求種類較豐富而敏感，對(duì)氮源的需求種類則相對(duì)單一而穩(wěn)定，多為蛋白胨和酵母膏。因此，對(duì)于不同離褶傘菌株在培養(yǎng)前有必要做碳源適宜性篩選試驗(yàn)。

4 結(jié)論

本研究中采集到的野生毛尖蘑菌株經(jīng)ITS序列分析鑒定為褐離褶傘。利用單因子試驗(yàn)篩選出毛尖蘑菌絲生長適宜的碳源為可溶性淀粉和麥芽糖，適宜氮源為蛋白胨、硫酸銨和酵母膏。最佳培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉（麥芽糖） 20 g、蛋白胨（硫酸銨、酵母膏） 2 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、瓊脂18 g，水 1 L。