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        中國茶葉生物化學(xué)研究40年

        2019-10-21 06:38:24張梁陳琪宛曉春李大祥
        中國茶葉 2019年9期
        關(guān)鍵詞:途徑研究

        張梁,陳琪,宛曉春,李大祥

        安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,230036

        茶葉生物化學(xué)是以茶葉(茶樹)為研究對象,通過現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識并掌握茶葉中特有次生代謝產(chǎn)物合成、降解、代謝基本原理的一門科學(xué)。茶葉生物化學(xué)研究范疇涵蓋了茶葉生物體內(nèi)的化學(xué)成分特點(diǎn)、變化規(guī)律及機(jī)制機(jī)理等一系列內(nèi)容。茶樹屬于山茶科山茶屬植物,含有特殊的次生代謝產(chǎn)物,如咖啡堿、茶氨酸和兒茶素等。這類物質(zhì)對于茶葉品質(zhì)形成至關(guān)重要,而且也是茶樹生物化學(xué)研究的主要對象。

        我國在1980年重新組織出版了《茶葉生物化學(xué)》一書,作為高等院校茶學(xué)相關(guān)專業(yè)的教材使用。改革開放促使現(xiàn)代生物化學(xué)研究水平的發(fā)展,茶葉香氣的研究在氣相色譜等儀器發(fā)展的基礎(chǔ)上得到快速進(jìn)步。上世紀(jì)80年代,我國開始對不同茶類的香氣物質(zhì)進(jìn)行了分析研究,并且組織各種規(guī)模的學(xué)術(shù)研討會,有力地推動了茶葉生物化學(xué)的交流和發(fā)展。同時(shí),我國商業(yè)部開始組織專家對茶葉的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行制定,規(guī)范了茶葉的生產(chǎn)和品質(zhì)控制。

        20世紀(jì)80—90年代,國內(nèi)涌現(xiàn)出一批研究茶葉特征成分生物合成和轉(zhuǎn)化機(jī)理的學(xué)者,其研究的范圍涵蓋了茶樹的栽培育種、制茶過程中特征成分的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化和機(jī)制等各個(gè)方面。這些研究逐步形成了茶學(xué)研究的主流方向,例如茶樹生理學(xué)、茶葉加工化學(xué)、茶葉成分的生物合成等。另外,隨著分析化學(xué)技術(shù)手段的進(jìn)步,大量新型的分析方法被應(yīng)用于茶葉品質(zhì)成分的研究,氣相色譜、液相色譜、紅外光譜、紫外-可見光光譜等技術(shù)極大地豐富了茶葉生物化學(xué)研究手段,提高了茶葉生化的研究水平。

        上世紀(jì)90年代至本世紀(jì)初,茶葉生物化學(xué)的發(fā)展又進(jìn)入了一個(gè)新階段。在這個(gè)階段,除了國內(nèi)學(xué)者團(tuán)體的不斷發(fā)展壯大,一些國外研究學(xué)者也開始茶葉生物化學(xué)的研究。隨著我國科研投入的增加,國內(nèi)形成了一批專門的茶葉研究機(jī)構(gòu),例如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等。

        隨著茶樹基因組的破解,以及現(xiàn)代生化研究方法和技術(shù)手段的發(fā)展,近年來茶葉生物化學(xué)的研究日新月異,大量高水平的研究成果不斷涌現(xiàn)。迄今,Camellia sinensis(小葉種)和Camellia assamica(大葉種)茶樹的基因組都已經(jīng)繪制完成,對于其中某些標(biāo)志性次生代謝產(chǎn)物的代謝通路關(guān)鍵基因也逐步清晰[1-2]。

        為了能夠系統(tǒng)地綜述茶葉生物化學(xué)的最新發(fā)展前沿,筆者按照茶葉生物化學(xué)的研究對象,在前人綜述論文的基礎(chǔ)上[3-4],概述了近40年來咖啡堿、兒茶素和茶氨酸的生物合成,以及茶葉加工化學(xué)、品質(zhì)化學(xué)的相關(guān)研究成果。

        一、茶樹主要成分的次生代謝

        1.咖啡堿的生物合成

        咖啡堿是一類嘌呤類生物堿,是茶葉中非常重要的一個(gè)次生代謝產(chǎn)物,咖啡堿含量占干重的2.50%~4.50%[5]。除了咖啡堿之外,茶葉中還含有一定量的可可堿,以及極其微量的茶堿[6]。茶樹體內(nèi)除種子外,其他部位均含有咖啡堿。其中,葉中含量較高,莖梗次之,花、果最少??Х葔A呈苦味,且有較強(qiáng)的興奮性,一般認(rèn)為它在茶樹體內(nèi)扮演生物防御的作用,能夠保護(hù)幼嫩組織免受害蟲的傷害[7]。在茶樹葉片生長過程中,咖啡堿在幼嫩葉片中含量最高,隨葉片老化其含量逐漸降低。咖啡堿含量也受季節(jié)影響,夏茶中咖啡堿含量常比春茶和秋茶高。

        茶樹(Camellia sinensis)的咖啡堿含量高于可可堿,但是可可茶(Camellia ptilophylla)中則幾乎不含有咖啡堿,卻含有非常豐富的可可堿,含量可以達(dá)到6.5%左右[8]。由此可見,這些嘌呤類生物堿在山茶科的植物分布中存在著比較顯著的種屬差異性。我國的低咖啡堿茶樹資源非常豐富,例如大壩大樹茶(0.07%)、金廠大樹茶(0.06%)、鹽津牛寨茶(<1.0%)和厚軸茶(<1.0%)等[9]。

        目前,咖啡堿的生物合成途徑比較清晰,其中關(guān)鍵的酶也都已經(jīng)基本解析,但是仍有一些合成通路的酶尚不明確??Х葔A(1,3,7-三甲基黃嘌呤)的生物合成是以黃嘌呤核苷(XR)為底物,通過三步甲基化、一步脫核苷酸化的核心途徑來實(shí)現(xiàn)的[10]。茶樹中咖啡堿的生物合成途徑主要是多個(gè)N-甲基轉(zhuǎn)移酶參與甲基化而將黃嘌呤核苷轉(zhuǎn)化為咖啡堿的過程,具體轉(zhuǎn)化過程為:黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤→可可堿(3,7-二甲基黃嘌呤)→咖啡堿(圖1),該途徑也是其他含咖啡堿植物中咖啡堿的主要生物合成途徑。一般所謂的咖啡堿合成酶(TCS),主要是催化最后兩步的甲基化(從7-甲基黃嘌呤→3,7-二甲基黃嘌呤→1,3,7-三甲基黃嘌呤)。另外,咖啡堿的合成還有一條次要途徑,通過7-甲基黃嘌呤→1,7-二甲基黃嘌呤→咖啡堿。

        咖啡堿合成過程中的甲基供體是S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM),通過N-甲基轉(zhuǎn)移酶類(NMTs)催化黃嘌呤三步甲基化,最終生物合成咖啡堿。這3種甲基化轉(zhuǎn)移酶分別是黃嘌呤核苷N-甲基轉(zhuǎn)移酶(7-NMT)、7-甲基黃嘌呤N-甲基轉(zhuǎn)移酶(3-NMT)和3,7-甲基黃嘌呤轉(zhuǎn)移酶(1-NMT),其中3-NMT的活性最高,是7-NMT及1-NMT活性總和的10倍以上。由于3-NMT和1-NMT具有幾乎相同的性質(zhì),人們把這兩種酶看作為同一種酶,也就是目前已經(jīng)解析的TCS。

        圖1 咖啡堿生物合成途徑

        TCS基因 (CsCS1,GenBank:AB031280) 在茶樹中被克隆之后,研究發(fā)現(xiàn)其合成酶基因存在突變。以可可茶為例,其咖啡堿合成酶(CpCS)由于個(gè)別氨基酸的突變失去了常規(guī)茶咖啡堿合成酶(TCS1)的正常功能,使可可堿(3,7-二甲基黃嘌呤)不能催化成為咖啡堿,從而導(dǎo)致可可堿的含量較高。茶樹NMT的獨(dú)立和快速的進(jìn)化機(jī)制導(dǎo)致了TCS1具有豐富的等位變異[11]。目前,已經(jīng)從茶樹中發(fā)現(xiàn)了6種TCS1的等位基因,其中TCS1a是主要基因,其他基因存在于一些野生種茶樹里面,例如不含咖啡堿的紅芽茶。也正是由于TCS1序列變異多樣,導(dǎo)致TCS1酶活性多樣,從而形成了我國茶樹資源中嘌呤生物堿具有不同的分布模式。Zhu等[12]利用山茶屬植物咖啡堿含量不同的特點(diǎn),選擇了Camellia crassicolumna等低咖啡堿植物作為對照,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)等手段發(fā)現(xiàn)了咖啡堿降解為可可堿的途徑。

        次黃嘌呤核苷酸是腺嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸及咖啡堿合成的前體物質(zhì),茶樹中咖啡堿的合成可以分為核心途徑和供體途徑,其中合成黃嘌呤核苷有4種途徑,黃嘌呤核苷酸可以繼續(xù)合成咖啡堿,次黃嘌呤核苷酸脫氫酶參與了其中3種供體途徑。

        次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAM)也是咖啡堿合成過程中兩個(gè)關(guān)鍵酶,IMPDH基因在葉內(nèi)表達(dá)量高于根和莖[13]。茶樹次黃嘌呤核苷酸脫氫酶催化次黃嘌呤核苷酸合成黃嘌呤核苷酸,其cDNA全長序列被克隆,命名為TIDH,對其在不同組織器官中的表達(dá)也有初步研究[14]。研究發(fā)現(xiàn),可以通過抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶活性增加次黃嘌呤核苷酸的量來培育低咖啡堿茶樹。

        茶樹新梢嫩葉中TCS表達(dá)量較高,與咖啡堿含量變化一致,同時(shí)檢測到較強(qiáng)的一甲基轉(zhuǎn)移酶活性,表明嫩葉中咖啡堿生物合成主要受到基因水平上的調(diào)控和底物水平控制。

        茶樹咖啡堿分解代謝途徑通常是通過7-N-脫甲基酶介導(dǎo)脫去7位甲基而成為茶堿,茶堿再脫甲基成3-甲基黃嘌呤和黃嘌呤,最后經(jīng)嘌呤代謝途徑分解成CO2、NH3和尿素。目前,咖啡堿在茶樹中的末段的生物合成途徑基本清晰,但是前端的某些關(guān)鍵酶的基因還不能確定。7-甲基黃嘌呤核苷合成酶是催化黃嘌呤核苷成為7-甲級黃嘌呤的關(guān)鍵酶,但是目前這個(gè)關(guān)鍵酶還未被確證,其基因也不明確;是否存在3-甲基黃嘌呤直接合成可可堿的途徑也尚未確證。

        2.茶氨酸的生物合成

        茶氨酸(Theanine)是茶葉中特有的一類非蛋白質(zhì)氨基酸,化學(xué)名為5-N-乙基-γ-谷氨酰胺或γ-谷氨酰-L-乙胺。迄今為止,已經(jīng)在很多山茶科植物中檢出了茶氨酸,不過它在Camellia sinensis和Camellia assamica中含量較高。目前,一般認(rèn)為茶樹體內(nèi)乙胺和谷氨酸在茶氨酸合成酶作用下生成茶氨酸[15]。

        茶氨酸是茶樹主體氨基酸,其存在于除果實(shí)以外的茶樹各個(gè)器官,嫩葉中含量最高,其次分別是根皮、吸收根、老葉和莖等。在茶樹新梢萌發(fā)前,供給茶樹的氨態(tài)氮主要以茶氨酸、谷氨酰胺和精氨酸為主,這些氮源主要貯藏在根部和葉部;隨著茶樹的萌發(fā),這些化合物轉(zhuǎn)移到新梢,尤以茶氨酸濃度最高。

        茶氨酸合成代謝途徑基因包括直接參與合成的茶氨酸合成酶基因和茶氨酸水解酶基因,以及控制主要前體物乙胺來源的丙氨酸脫羧酶基因等。茶氨酸合成酶(TS)即L-谷氨酸-乙胺連接酶,是茶氨酸合成的關(guān)鍵酶,催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸。

        研究表明,茶葉中的茶氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶(GS)具有高度的基因同源性,TS1基因與GS3基因有99%相同,而TS2基因與GS1基因有97%相同,因此推測兩個(gè)基因可能源于GS家族,因?yàn)榘被嵬蛔儗?dǎo)致酶學(xué)功能產(chǎn)生差異,使得TS具有催化谷氨酸轉(zhuǎn)乙胺基合成茶氨酸功能,而普通植物中的GS只有催化谷氨酸轉(zhuǎn)氨基合成谷氨酰胺的能力[16]。茶氨酸合成酶TS在ATP存在的條件下,能以L-谷氨酸和乙胺為底物催化合成茶氨酸,而作為茶氨酸組成部分的乙胺則是茶樹新梢兒茶素間苯三酚核的直接前體,茶氨酸代謝通路的水解產(chǎn)物乙胺還參與了兒茶素的生物合成。

        茶氨酸合成酶(TS)是茶氨酸合成代謝的關(guān)鍵酶,在ATP、Mg2+、K+存在的條件下,茶籽苗勻漿能夠催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸。目前,宛曉春課題組從茶樹基因組中找到了5條GS基因序列,分別命名為CsTSI、CsGSII-1a、CsGSII-1b、CsGSII-1c 和 CsGSII-2a[1]。其中 CsTSI具備體外合成茶氨酸的能力,與較為古老的藻類、細(xì)菌中的I型GS同源性較高,因此分類為CsTSI。 CsGSII-1a、 CsGSII-1b、 CsGSII-1c 和 CSGSII-2a均為II型GS。轉(zhuǎn)基因植物研究表明,CsTSI具有雙功能酶特性,即可催化谷氨酸合成谷氨酰胺,又可合成茶氨酸,而其酶學(xué)特性切換主要受底物乙胺的調(diào)控。

        TS1基因在茶樹芽頭和根部表達(dá)幾乎相當(dāng),但是TS2在茶樹芽頭的表達(dá)要高于根部。Liu等人研究了茶籽苗各部位茶氨酸合成酶基因的表達(dá)差異,結(jié)果表明TS1在新梢中表達(dá)量高于其他部位,根部相對較低[17]。Deng等[18]研究了咖啡堿和茶氨酸合成的特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)咖啡堿只在葉片和莖部合成,而茶氨酸在根部合成。

        Cheng等[15]認(rèn)為乙胺是茶氨酸生物合成過程中的關(guān)鍵前體,因?yàn)椴璋彼岷铣伤枰墓劝彼嵩诤芏嘀参镏卸即嬖冢且野分饕嬖谟谏讲杩频闹参镏?,尤其是在Camellia sinensis中。乙胺作為茶氨酸的合成前體物質(zhì),在茶樹根部由丙氨酸脫羧酶將丙氨酸脫去羧基生成。最近,Bai等[19]從茶樹中克隆了1條新的絲氨酸脫羧酶(SDC)的基因,該基因具有很強(qiáng)的催化丙氨酸脫羧的作用,它在茶樹根部的表達(dá)高于葉片,該基因被命名為丙氨酸脫羧酶(AlaDC)。谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOGAT,又稱谷氨酸合酶),能將GS催化生成的谷氨酰胺催化生成谷氨酸。此外,谷氨酸脫氫酶(GDH)催化α-酮戊二酸發(fā)生還原氨基化反應(yīng),生成谷氨酸。茶氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至葉部后在茶氨酸水解酶作用下降解為谷氨酸和乙胺。

        茶氨酸合成酶需要K+和磷酸鹽維持它的活性。在茶葉采摘后的前10 h,此水解酶活力增加,隨后逐漸下降,而谷氨酰胺酶活力不斷下降,采摘48 h后幾乎失去活性。秋冬增施含氮基肥、采前遮陰、控制日采摘時(shí)間、噴施含茶氨酸前體葉面肥等措施可以提高鮮葉氨基酸(茶氨酸)含量。Liu等[20]關(guān)注了茶葉采摘之后在不同溫度和光照條件下(遮陰)茶氨酸含量變化以及相關(guān)基因的表達(dá)差異。高溫條件下,茶氨酸的含量顯著降低,通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)GOGATs在處理過程中變化較大,但是茶氨酸合成酶相關(guān)表達(dá)變化不大,加熱條件下CsNADH-GOGAT表達(dá)下調(diào),且茶氨酸含量降低。CsFd-GOGAT(鐵氧還原蛋白-谷氨酰胺谷氨酸合成酶)表達(dá)水平與茶氨酸含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。盡管以上兩個(gè)酶基因不是茶氨酸合成的關(guān)鍵基因,但是也屬于其前體物質(zhì)谷氨酸的關(guān)鍵合成基因[20],因此也可以通過谷氨酸的合成來調(diào)控茶氨酸的含量。

        一些研究還發(fā)現(xiàn)氣候,如氣溫等因素也會影響茶氨酸的生物合成。高溫條件下,尤其是夏秋茶中茶氨酸的含量顯著低于春茶,其主要原因可能是高溫導(dǎo)致GOGAT等茶氨酸合成酶的活性增加,降低了茶氨酸前體的合成,從而降低茶氨酸含量[21]。

        隨著茶葉中茶氨酸合成途徑及相關(guān)基因研究的深入,已經(jīng)有一些基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)應(yīng)用于茶氨酸的生物發(fā)酵。通過構(gòu)建具有茶氨酸合成能力的基因工程菌來發(fā)酵生產(chǎn)茶氨酸是其體外生物合成的一條有效途徑[22]。

        3.兒茶素的生物合成

        兒茶素類化合物(Catechins)是2-苯基苯并吡喃的衍生物,屬于類黃酮化合物(Flavonoids)中的黃烷-3-醇類(Flavan-3-ols)。類黃酮分子中的A環(huán)是由3個(gè)乙酸分子頭尾相接而成的,而B環(huán)與C環(huán)上的碳原子則來自于由莽草酸途徑合成的苯丙氨酸。苯丙氨酸經(jīng)過苯丙酸鹽途徑形成查爾酮后,再進(jìn)入各種不同的類黃酮合成途徑,形成不同的黃酮類物質(zhì)。這些黃酮類物質(zhì)的生物合成途徑具有部分的同源性。

        茶樹中主要多酚類物質(zhì)——兒茶素類合成是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)途徑,涉及莽草酸途徑、苯丙烷類代謝途徑和類黃酮合成途徑,并形成多種產(chǎn)物(圖2)。葉片中的兒茶素類化合物特別是酯型兒茶素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根中,但后者的原花青素(聚合的兒茶素)含量是葉片的數(shù)倍,說明葉中的兒茶素類化合物后期的合成是以沒食子酰基化反應(yīng)為主,而根中是以原花青素聚合反應(yīng)為主[23]。

        植物體中類黃酮化合物的B環(huán)羥基數(shù)目受黃酮-3'-羥化酶(F3'H)和黃酮-3',5'-羥化酶(F3'5'H)基因的調(diào)控,順式和反式兒茶素含量受花色素還原酶(ANR)和無色花色素還原酶(LAR)基因的控制,但是酯型兒茶素的沒食子?;瘷C(jī)理尚不完全清楚。Niemetz等[24]系統(tǒng)研究了水解單寧合成的相關(guān)酶類,推測1-O-沒食子酰-β-葡萄糖(βG)是單寧合成有效的?;w和受體。利用體外酶學(xué)手段,揭示了反式兒茶素C和GC的合成模式,發(fā)現(xiàn)在DFR和LAR催化下,二氫黃酮醇形成無色花青素即花白素,然后形成反式兒茶素C和GC。兒茶素的合成過程中,花青素合成酶(CsANS)是一個(gè)重要的關(guān)鍵酶。前期研究發(fā)現(xiàn)光照是CsANS基因編碼的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因素。

        圖2 兒茶素生物合成途徑

        Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)1-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(UGGT)和O-沒食子?;D(zhuǎn)移酶(ECGT)是酯型兒茶素合成過程兩個(gè)關(guān)鍵酶。這兩個(gè)酶分別以尿苷二磷酸葡萄糖和1-O-沒食子?;?β-D-葡萄糖為底物。沒食子?;^程與水解單寧合成途徑具有相似性,即βG是它們合成的?;w。

        茶樹中的黃酮醇類物質(zhì)占干重的3%~4%,多以糖苷形式存在,在茶提取液的紙層析譜上就能鑒別出20多種,大部分是上述3種基本黃酮醇的各種糖苷。黃酮與黃酮醇的差別只是少1個(gè)3-羥基取代,在植物中它大多以黃酮糖苷的形式存在。

        Liu等[26]利用分析化學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的手段研究春季和秋季茶樹兒茶素生物合成的差異。秋茶中總兒茶素的含量顯著高于春茶,其中以EGC最為突出。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、黃酮-3-羥化酶(F3H)、黃酮-3',5'-羥化酶(F3'5'H)、二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)和花青素合成酶(ANS)的基因表達(dá)與兒茶素的含量密切相關(guān)。Zhang等[27]也研究了黃酮代謝通路中相關(guān)基因表達(dá)與兒茶素含量的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)查爾酮合酶1、查爾酮合酶3、花青素還原酶1、花青素還原酶2和無色花青素還原酶(LAR)的表達(dá)與兒茶素含量呈正相關(guān),其中花青素還原酶(ANR)和無色花青素還原酶的表達(dá)與酯型兒茶素(EGCG、ECG)含量呈正相關(guān)。

        近期有研究報(bào)道茶樹葉片的不同位置會影響其光合作用和呼吸。葉片的成熟過程中,呼吸速率以及總氮含量會持續(xù)下降,但是淀粉的含量卻會隨著成熟度的增加而增加。成熟葉片中葉綠素a和b的含量都顯著增加,另外,氨基酸和茶多酚的含量顯著降低[28]。還有一些學(xué)者通過基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的分析來探討茶樹3種特征性成分的相互調(diào)節(jié)關(guān)系[29],通過研究發(fā)現(xiàn)3類次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)基因相互影響,并且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)F3'5'H、FLS和βG不僅與EGCG的代謝相關(guān),還與咖啡堿代謝相關(guān)。Jin等[30]最近從貴州野生茶樹中發(fā)現(xiàn)了F3'5'H突變等位基因,其丟失了14個(gè)堿基對,從而導(dǎo)致F3'5'HmRNA表達(dá)水平很低,使得野生茶樹中三羥基兒茶素含量較低。Tai等人[31]還比較了茶樹和油茶(Camellia oleifera)在轉(zhuǎn)錄組水平的差異。

        Yang等[32]還研究了不同氮形態(tài)對于茶葉中主要次生代謝產(chǎn)物合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)施銨態(tài)氮(NH4+)對于茶樹次生代謝產(chǎn)物差異基因表達(dá)的影響大于施硝態(tài)氮(NO3-)或者同時(shí)施NH4+和NO3-。長時(shí)間給予NO3-會減少黃酮類的生物合成,但是會增強(qiáng)咖啡堿和茶氨酸的生物合成。Fan等[33]也比較了NH4+和NO3-兩種氮肥對茶樹次生代謝的影響,發(fā)現(xiàn)Cs-miR156是調(diào)節(jié)兒茶素次生代謝途徑中關(guān)鍵基因的一個(gè)調(diào)節(jié)基因。NO3-會增加芽頭中兒茶素的含量,并且PAL、CHS、CHI和DFR的相關(guān)基因也呈現(xiàn)出高表達(dá),Cs-miR156的高表達(dá)則受到NH4+的影響。Sun等[34]也試圖通過生物信息學(xué)的手段挖掘與兒茶素合成基因相關(guān)的miRNAs,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR529d和miR156g-3p分別是CHI和F3H兩種基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子。

        Chen等[35]還專門研究了茶樹與兒茶素異構(gòu)化相關(guān)基因的表達(dá)。特殊茶樹品種Y510含有較高含量的GCG和C,但是其EGC和EC含量卻很低。RNA序列分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)影響兒茶素異構(gòu)化的關(guān)鍵基因,花青素還原酶基因(CsANR1、CsANR2)和花青素合成酶基因。CsANS在擬南芥突變體tds4-2的過表達(dá)會導(dǎo)致EC含量顯著增加。Li等[36]也通過比較Camellia ptilophylla和Camel-lia sinensis兒茶素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的差異,發(fā)現(xiàn)Camellia ptilophyllaa的CpANS2與Camellia sinensis相似度僅有80%左右,推測其可能失去了合成cis-兒茶素的能力,從而導(dǎo)致白毛茶中表型兒茶素含量較低。

        甲基化兒茶素是另一類具有顯著生理活性的兒茶素衍生物。一般認(rèn)為,甲基化兒茶素也是通過黃酮類途徑合成,咖啡?;?CoA-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶是與甲基化兒茶素生物合成的關(guān)鍵酶[37]。研究發(fā)現(xiàn)CsWRKY31和CsWRKY48轉(zhuǎn)錄因子與甲基化兒茶素的合成有關(guān),這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)會抑制CsLAR、CsDFR、CCoAOMT基因的表達(dá)[38]。此外,Zhang等人[39]也發(fā)現(xiàn)ANL2、WRKY44和AtMYB113等轉(zhuǎn)錄因子也與兒茶素的合成相關(guān)。

        二、加工工序?qū)Σ枞~品質(zhì)化學(xué)的影響

        1.萎凋

        陳靜等[40]研究了白茶萎凋過程中茶多酚和兒茶素組分含量的變化,以及這些變化與其合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)萎凋32 h后,非酯型兒茶素EC、GC、EGC和酯型兒茶素ECG和EGCG的含量達(dá)到最高值,且這種含量變化與兒茶素合成途徑中關(guān)鍵酶PAL、C4H、F3H、F3'H、DFR、LAR、ANR基因的表達(dá)基本一致。因此提出在白茶萎凋中,適當(dāng)縮短萎凋時(shí)間,可以提高白茶品質(zhì)。

        劉亞峰等[41]利用通徑分析研究了萎凋槽和萎凋室中不同萎凋程度對紅茶化學(xué)成分與感官品質(zhì)之間的關(guān)系。在以空調(diào)和除濕機(jī)控溫控濕的萎凋室中,萎凋至水分含量58%~60%之間時(shí),紅茶品質(zhì)最好。茶多酚、游離氨基酸、茶黃素雙沒食子酸酯(TFDG)、EC、EGCG和ECG與感官品質(zhì)呈負(fù)相關(guān),而茶黃素(TF1)、茶黃素-3-單沒食子酸酯(TF-3-G)和茶黃素-3'-單沒食子酸酯(TF-3'-G)與感官品質(zhì)呈正相關(guān),且TF-3'-G是影響紅茶品質(zhì)的最主要成分。

        龐月蘭等[42]研究了萎凋程度對紅條茶品質(zhì)的影響,設(shè)置了56.00%~59.99%、60.00%~63.99%和64.00%~68.00%3個(gè)萎凋程度處理,發(fā)現(xiàn)凌云白毫茶紅條茶萎凋時(shí)間為17 h,萎凋葉含水量至60.00%~63.99%時(shí),成品茶香氣濃郁,湯色紅亮,滋味濃厚,葉底紅亮,茶黃素和茶紅素含量均較高。

        2.殺青

        吳本剛等[43]以鎮(zhèn)江金山翠芽茶鮮葉為原料,以蒸汽殺青為對照,研究了紅外殺青對茶葉品質(zhì)和理化成分的影響,確立了最優(yōu)的殺青干燥工藝條件為:紅外輻照距離20 cm殺青150 s,經(jīng)揉捻做形后,熱風(fēng)干燥溫度70℃、干燥40 min,制成品中維生素C和茶多酚保留量較高,外形色澤緊實(shí)翠綠,茶香明顯。同時(shí)建立了紅外殺青過程中PPO鈍化動力學(xué)模型和干燥過程中水分干燥動力學(xué)模型,可為殺青干燥過程預(yù)測提供理論參考。吳雅麗[44]綜述了殺青技術(shù)對改善夏秋茶品質(zhì)的研究進(jìn)展,指出蒸汽殺青有利于茶多酚物質(zhì)和蛋白質(zhì)的水解,氨基酸含量增加,有利于減少夏秋茶品質(zhì)的苦澀味。

        3.發(fā)酵

        發(fā)酵是紅茶加工中的關(guān)鍵過程,也是形成紅茶特有品質(zhì)的關(guān)鍵工序。Tan等[45]對工夫紅茶發(fā)酵過程中(0~14 h,2 h間隔取樣)的非揮發(fā)性成分進(jìn)行代謝組分分析表明,兒茶素、兒茶素二聚體、黃酮醇糖苷、氨基酸、酚酸、生物堿和核苷酸等成分發(fā)生了顯著變化;隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,兒茶素類、香豆素、原花青素B1和B2顯著下降,咖啡堿較穩(wěn)定,茶氨酸略降,而茶氨酸葡萄糖苷、楊梅素C糖苷、腺苷酸、香豆酰奎寧酸顯著上升。

        4.干燥

        郭桂義等[46]以低檔信陽毛尖毛茶為原料,研究了不同烘焙溫度和時(shí)間對品質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)烘焙能夠去除茶葉粗老氣和青草氣,有利于提高茶葉香氣,降低茶湯苦澀味,在100℃下烘焙15 min或30 min信陽毛尖茶的品質(zhì)最優(yōu),茶葉中的氨基酸、咖啡堿等物質(zhì)含量較高。

        陳義等[47]以不同嫩度的信陽夏茶紅茶為原料,研究了50℃的炭火溫度下,不同烘焙時(shí)間對茶葉感官品質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)炭火低溫長焙能夠改變信陽夏茶紅茶的感官品質(zhì),提高茶葉香氣,且水浸出物、茶多酚和咖啡堿含量均有不同程度的降低,從而降低了茶葉的澀味。其中一芽一葉和一芽二葉原料茶分別慢焙10.5 h,品質(zhì)最佳;而一芽二三葉原料茶葉則慢焙14 h品質(zhì)最佳。

        張麗等[48]以水仙、肉桂2個(gè)品種的武夷巖茶毛茶為原料,經(jīng)不同程度(130~150℃,2~4 h)焙火處理后。結(jié)果表明,隨著焙火程度的增加,醇類含量呈降低趨勢,酯類和酮類含量呈增加趨勢,其中具花果香的脫氫芳樟醇、己酸葉醇酯、己酸己酯等主要香氣物質(zhì)含量呈先增后減的變化趨勢,具烘烤香或焦糖香的香氣物質(zhì)(如1-乙基-1H-吡咯)呈增加趨勢,苯乙腈、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪和2-乙酰基呋喃等整體呈先增后減的變化趨勢。

        三、展望

        茶葉生物化學(xué)的研究是茶產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ),它將傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的茶產(chǎn)業(yè)提升到了涵蓋第一、第二和第三產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)。茶葉生物化學(xué)的基礎(chǔ)研究為茶葉的品種選育、加工提升以及精深產(chǎn)品延伸提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。然而,盡管近年來茶學(xué)研究的最新科技進(jìn)展不斷涌現(xiàn),但是也存在一些研究內(nèi)容雷同、研究方式類似的問題,尤其是近年來茶葉生物化學(xué)研究過程中積累的大量研究數(shù)據(jù)缺乏有效的溝通與共享。

        以茶葉加工化學(xué)的研究為例,加工過程中茶葉中主要物質(zhì)的變化規(guī)律受到許多因素的影響,例如基礎(chǔ)材料(鮮葉)的成分差異,成分之間的相互作用,加工條件和參數(shù)等因素的影響,這類加工化學(xué)的研究往往都具有一定的個(gè)體性,而難以代表不同茶類,甚至同類茶葉的規(guī)律。因此,以茶葉主要內(nèi)含物質(zhì)為基礎(chǔ),建立標(biāo)準(zhǔn)化的組合化學(xué)物,并以其為基礎(chǔ)模擬茶葉加工過程中熱、濕度、pH值、酶促反應(yīng)、單一/組合微生物發(fā)酵等條件,探究茶葉成分的變化規(guī)律,相互作用特點(diǎn),建立可重復(fù)、可參考的茶葉化學(xué)轉(zhuǎn)化模式,從而揭示茶葉加工過程中的生化變化特點(diǎn)。此外,國內(nèi)多個(gè)科研院所都分別建立了茶葉相關(guān)數(shù)據(jù),涵蓋了茶葉研究的各個(gè)方面,存在著一定的重復(fù)建設(shè)和資源浪費(fèi)。因此,我們也亟待建立區(qū)域間協(xié)作,甚至是國際范圍內(nèi)的茶葉生物(基因)和化學(xué)數(shù)據(jù)庫,供全球茶葉研究者和公眾使用。

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