1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院食品藥品工程系 湖南長(zhǎng)沙 410208 2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心 湖南長(zhǎng)沙 410208 3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖南長(zhǎng)沙 410128

豬肉作為主要的肉制品來(lái)源材料之一，是人們從肉制品中攝入蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一。而蛋白質(zhì)又可分為水溶性蛋白質(zhì)，鹽溶性蛋白質(zhì)。鹽溶性蛋白質(zhì)中的肌肉鹽溶性蛋白質(zhì)主要有肌球蛋白，肌動(dòng)蛋白等，這些蛋白是具有形成良好熱誘導(dǎo)凝膠的能力[1]，而熱誘導(dǎo)凝膠能力是肉制品加工過(guò)程中重要的功能特性之一，其可以極大影響到加工過(guò)程中肉制品的工藝特性和感官品質(zhì)，故而對(duì)鹽溶性蛋白質(zhì)的溶解性、凝膠特性的研究一直受到廣泛的關(guān)注[2]。其次，不同蛋白質(zhì)組分也對(duì)于熱誘導(dǎo)凝膠形成具有較大影響[3]。

目前已有的研究表明，豬背最長(zhǎng)肌鹽溶性蛋白中的肌球蛋白是一種對(duì)鹽溶性蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)有著極其重要影響的功能性蛋白[4],有關(guān)雞胸肉鹽溶性蛋白凝膠特性影響的研究結(jié)論也符合豬肉鹽溶性蛋白的結(jié)論[5]。同時(shí),提取鹽溶性蛋白的條件也對(duì)鹽溶性蛋白凝膠的質(zhì)地有著影響，如靳紅果[6](2008)等研究了NaCl、MgCl2和pH值對(duì)牛背最長(zhǎng)肌鹽溶性蛋白質(zhì)，凝膠保水性和凝膠強(qiáng)度的影響；顏偉華[7](2010)等研究了NaCl濃度、pH值、靜置提取時(shí)間及加熱時(shí)間對(duì)魚(yú)肉鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠保水性和質(zhì)構(gòu)特性的影響。雖然，這類(lèi)研究在探究提取條件對(duì)鹽溶性蛋白質(zhì)凝膠特性影響時(shí)，也調(diào)整過(guò)鹽溶性蛋白的提取工藝，但是相關(guān)研究大都一帶而過(guò)，同時(shí)不同類(lèi)型不同部位肉的鹽溶性蛋白含量、結(jié)構(gòu)及蛋白組分也有差異。本實(shí)驗(yàn)主要選擇三個(gè)不同影響因素，NaCl溶液濃度、MgCl2溶液濃度和pH值，探究他們對(duì)豬里脊肉的鹽溶性蛋白提取率的影響，并設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料和試劑

材料:豬肉里脊肉，采購(gòu)于湖南新五豐食品有限公司同一批次，同一部位的樣本。

試劑：蛋白測(cè)定試劑盒(雙縮脲法)，購(gòu)于南京建成生物科技有限公司；其他常見(jiàn)試劑均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

電子天平CP413型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)721型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

可調(diào)速勻漿器FSH-2型，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠(chǎng)；

電子恒溫水浴鍋DZKW-4型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

離心機(jī)TGL16M型，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬肉樣品的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取120g瘦肉、30g肥肉切成小塊，用絞肉機(jī)攪碎成肉糜；稱(chēng)取4g瘦肉、1g肥肉混合均勻，制作30份留待備用。

1.2.2 豬肉鹽溶性蛋白的提取與測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00g肉糜(4.00g瘦肉、1.00g肥肉)樣本于50mL離心管中，加入40mL(0.2mol/L)pH=6.5的磷酸鹽緩沖液(0.6mol/L NaCl,0.03mol/L MgCl2)，5 000r/min勻漿1.5min,4℃靜置18h,10 000r/min離心15min，取上清液，為鹽溶性蛋白質(zhì)溶液。用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，按照試劑盒指導(dǎo)進(jìn)行測(cè)定，蛋白質(zhì)溶液定量后立即使用或置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 不同濃度NaCl的提取實(shí)驗(yàn)

在磷酸鹽緩沖液pH值為7，MgCl2溶液濃度為0.03mol/L的條件下，對(duì)比不同濃度NaCl溶液(0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mol/L)對(duì)于豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響。

1.2.3.2 不同濃度MgCl2的提取實(shí)驗(yàn)

在磷酸鹽緩沖液pH值為7，NaCl溶液濃度為0.3mol/L的條件下，對(duì)比不同濃度MgCl2溶液(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L)對(duì)于豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響。

1.2.3.3 不同pH值的提取實(shí)驗(yàn)

在NaCl溶液濃度為0.3mol/L，MgCl2溶液濃度為0.03mol/L的條件下，比較不同濃度pH值溶液(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)對(duì)于豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

想要進(jìn)一步優(yōu)化豬肉糜鹽溶性蛋白提取的較佳參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用spss25.0軟件設(shè)計(jì)L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel2016和IBM SPASS 25.0進(jìn)行整理與分析，采用LSD檢驗(yàn)組間的差異，p<0.05作為差異顯著的標(biāo)志。

2 結(jié)果和討論

2.1 不同NaCl濃度對(duì)豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響

在1.2.3.1實(shí)驗(yàn)中，伴隨著NaCl濃度變化即濃度升高，提取所得豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)濃度變化趨勢(shì)，呈現(xiàn)為先升高然后下降(p<0.05)，當(dāng)NaCL濃度達(dá)到0.6mol/L時(shí)，提取所得鹽溶性蛋白質(zhì)溶液濃度達(dá)到最大值(見(jiàn)圖1)。

圖1 不同NaCl濃度下鹽溶性蛋白提取濃度Fig. 1 extraction concentration of salt-soluble protein at different NaCl concentrations

經(jīng)分析，這可能是蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析現(xiàn)象，蛋白質(zhì)的提取受中性鹽的影響，伴隨著中性鹽氯化鈉溶液濃度的變化，改變了蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的電子分布，蛋白質(zhì)分子表面電荷隨之增加，改變了蛋白質(zhì)分子和水分子的相互作用力，即增強(qiáng)兩者之間的作用，反映為蛋白質(zhì)在水溶液中溶解度增加；但是這種現(xiàn)象不會(huì)一直持續(xù)，當(dāng)中性鹽溶液濃度超過(guò)一定的閾值時(shí)，就會(huì)抑制蛋白質(zhì)分子溶于水；此外，Pietrasik[8](2003)等研究發(fā)現(xiàn)較低添加量的中性鹽氯化鈉可能會(huì)抑制鹽溶性蛋白的萃取，降低蛋白質(zhì)的水合能力。因此，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選取NaCl溶液濃度為0.5、0.6、0.7mol/L的三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 不同MgCl2濃度對(duì)豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響

在實(shí)驗(yàn)1.2.3.2中，伴隨著MgCl2溶液濃度變化即濃度不斷升高，提取所得豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)溶液濃度也隨之變化，變化趨勢(shì)大致為先升高后下降(p<0.05)，當(dāng)鹽溶性蛋白質(zhì)濃度達(dá)到最高值時(shí)，此時(shí)MgCl2溶液濃度為0.02mol/L(見(jiàn)圖2)。

圖2 不同MgCl2濃度下鹽溶性蛋白提取濃度Fig. 2 concentration of salt soluble protein extraction at different concentrations of MgCl2

我們已經(jīng)知道，蛋白質(zhì)溶解度的大小受到中性鹽添加量的影響，低濃度稀MgCl2溶液剛開(kāi)始添加時(shí)，溶液中Mg2+濃度相對(duì)增加，溶液中離子強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，離子間相互作用，致使蛋白質(zhì)分子和水分子的相互作用也隨之增強(qiáng)，反映為蛋白質(zhì)溶解度增大，提取濃度升高，Chang H S.[9](2001)等對(duì)MgCl2、焦磷酸鈉對(duì)雞胸肌肌球蛋白的增溶和凝膠化作用的研究也證明了這一點(diǎn)；但是伴隨著中性鹽氯化鎂溶液濃度的不斷升高，溶液中的Mg2+濃度逐漸超過(guò)閾值，過(guò)高的Mg2+濃度，對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的電荷分布造成了影響，降低了蛋白質(zhì)分子的水和能力，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子之間的作用，反映為蛋白質(zhì)溶解度降低，提取濃度隨之下降。

2.3 不同pH對(duì)豬肉糜鹽溶性蛋白提取效果的影響

在實(shí)驗(yàn)1.2.3.3中，伴隨著溶液pH值的增加，提取所得豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)溶液濃度也隨之變化，大致趨勢(shì)呈現(xiàn)為先升高而后下降(p<0.05)，當(dāng)鹽溶蛋白質(zhì)溶液濃度達(dá)到最大值時(shí)，此時(shí)pH值為6.5(見(jiàn)圖3)。

圖3 不同pH值下鹽溶性蛋白提取濃度Figure 3 extraction concentration of salt soluble protein at different pH values

多方資料證明，pH值可以用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，高于或者低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)都會(huì)影響到蛋白質(zhì)的溶解度。改變?nèi)芤簆H值，使其高于或低于蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子因此得以攜帶凈的負(fù)電荷或凈的正電荷，同性相斥，蛋白質(zhì)分子間相互作用能力減弱；相對(duì)的，蛋白質(zhì)分子和水分子間的相互作用能力增強(qiáng)，反映為蛋白質(zhì)溶解度升高，蛋白質(zhì)提取濃度升高；與之相反的是，當(dāng)溶液pH值靠近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子和水分子的相互作用能力減弱，蛋白質(zhì)分子相互聚集，難以分離。因此，選取pH值為6.0、6.5、7.0三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)中，提取豬肉糜鹽溶性蛋白的各組提取效果數(shù)據(jù)，得出相對(duì)較優(yōu)的條件設(shè)置區(qū)間，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，如表1。

表1 因素水平表L9(34)

由方差分析得知，本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，NaCl、MgCl2兩個(gè)因素均對(duì)豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取效果有顯著影響(P均小于0.05)，見(jiàn)表2。由極差分析得知，正交試驗(yàn)設(shè)置的三種因素對(duì)豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響由小到大排序：NaCl、MgCl2、pH值，如表3。通過(guò)極差分析表可以得知對(duì)于豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取條件的最優(yōu)組合是：濃度為0.6mol/L的NaCl、濃度為0.03mol/L的MgCl2、pH值為6.5。

表2 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果

3 結(jié)論

綜上，從單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)中分析得知，在提取豬肉鹽溶性蛋白質(zhì)的時(shí)候，本實(shí)驗(yàn)所選取的三個(gè)影響因素，NaCl、MgCl2和pH值均為影響提取率的重要因素。在用spss 25.0對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，從方差分析結(jié)果可知，NaCl、MgCl2兩個(gè)因素均對(duì)豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取效果有顯著影響(P均<0.05)，對(duì)豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響由小到大排序：NaCl、MgCl2、pH值，從極差分析結(jié)果可知，對(duì)于豬肉糜鹽溶性蛋白質(zhì)提取條件的最優(yōu)組合是：濃度為0.6mol/L的NaCl、濃度為0.03mol/L的MgCl2、pH值為6.5。豬肉鹽溶性蛋白質(zhì)形成的熱誘導(dǎo)凝膠的保水性和質(zhì)構(gòu)特性是評(píng)價(jià)豬肉品質(zhì)的重要考察因素之一，對(duì)于提升豬肉品質(zhì)有著重要的作用，因此提高鹽溶性蛋白質(zhì)的提取率有著重要的意義。