張靚璠，嚴(yán)愷，王英，黃莉

（1.義烏市婦幼保健院 計(jì)劃生育服務(wù)中心，浙江 金華 322000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖遺傳科，浙江 杭州 310000）

Meckel綜合征是一種致死性的常染色體隱性遺傳病，由Meckel等在1822年首次報(bào)道。典型臨床癥狀包括腎囊腫、內(nèi)生殖器異常、軸后多指畸形、肝纖維化、無腦畸形、唇腭裂、枕葉腦膨出等。

該病在不同國(guó)家新生兒中的發(fā)病率不同，在英國(guó)約為1/140 000[1]，在芬蘭約為1/9 000[2]，在印度古吉拉特邦中發(fā)病率則高達(dá)1/1 304[3]，而在我國(guó)目前僅見散發(fā)病例報(bào)道，尚無相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。該病預(yù)后差，胎兒常發(fā)生宮內(nèi)死亡，出生的胎兒大多僅能存活數(shù)天至數(shù)周且沒有治療措施，因此臨床上與該疾病相關(guān)的研究較少。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因檢測(cè)技術(shù)已成為一種發(fā)現(xiàn)新致病位點(diǎn)和進(jìn)行遺傳病診斷的有效途徑，并在不斷地發(fā)展與完善。本研究中，我們對(duì)義烏市婦幼保健院收集到的1例疑似Meckel綜合征的引產(chǎn)胎兒組織及其家系成員進(jìn)行了遺傳學(xué)檢測(cè)，利用全外顯子高通量測(cè)序技術(shù)及Sanger測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了CC2D2A基因上的2個(gè)致病性突變c.3964C＞T和c.4567T＞C。本研究豐富了Meckel綜合征的致病性突變數(shù)據(jù)庫，并為該家系遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷及胚胎植入前診斷提供了遺傳學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象先證者母親，G5P2，既往體健，2007年行甲狀腺結(jié)節(jié)切除術(shù)，術(shù)后恢復(fù)尚可，無高血壓、糖尿病、心臟病等疾病史，無肝炎、結(jié)核等傳染病史，無輸血史，無明顯藥物、食物過敏史，無長(zhǎng)期藥物使用史，無藥物成癮。第1胎足月自然分娩女嬰，健康；第2胎自愿人工流產(chǎn)；第3、第4胎，均為男胎，分別于妊娠13+和19+周時(shí)，B超顯示枕葉腦膨出和多囊腎，經(jīng)慎重考慮終止妊娠；第5胎，足月自然分娩一健康女嬰。家系圖譜見圖1。

圖1 Meckel綜合征家系圖譜

1.2 方法根據(jù)先證者胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常的相關(guān)結(jié)果，我們對(duì)第3胎引產(chǎn)胎兒組織及其父母、姐妹進(jìn)行了遺傳學(xué)檢測(cè)。該研究項(xiàng)目通過了本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)，并取得了先證者父母簽署的知情同意書。取先證者胎兒腓腸肌組織，用0.9%氯化鈉溶液漂洗排除母血污染，使用基因組雜交芯片（comparative genomic hybridization，CGH）和全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing，WES）技術(shù)對(duì)先證者染色體組及外顯子組進(jìn)行檢測(cè)；分別取先證者父母及其姐妹的EDTA抗凝外周血5 mL，針對(duì)先證者發(fā)現(xiàn)的致病位點(diǎn)，通過Sanger測(cè)序?qū)蚁颠M(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.1 CGH檢測(cè):按照Qiagen試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程提取血液中基因組DNA。染色體芯片采用Agilent Sure-Print G3 Custom CGH+SNP Microarray（4×180 K），操作步驟簡(jiǎn)述如下:用限制性內(nèi)切酶酶切對(duì)照及樣本基因組，以Cy3-dUTP和Cy5-dUTP分別標(biāo)記對(duì)照和樣本基因組DNA，純化后測(cè)定標(biāo)記效率及DNA量，將已標(biāo)記的對(duì)照及樣本基因組DNA混合，位于芯片上雜交，洗滌芯片后選擇合適的掃描通道在Agilent掃描儀上掃描，掃描結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)換，得到每個(gè)位點(diǎn)的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)行作圖與分析。

1.2.2 WES檢測(cè):超聲將胎兒基因組DNA打斷，獲得200～250 bp大小的DNA片段，純化后，對(duì)DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)、添加單堿基A以及測(cè)序接頭，篩選出片段適中的DNA片段構(gòu)成原始文庫，PCR擴(kuò)增后完成DNA建庫。使用SeqCap EZ Human Exome Probes v3試劑盒，將文庫與探針庫進(jìn)行雜交，捕獲基因的外顯子，洗滌后將外顯子DNA富集，再次PCR擴(kuò)增，純化后得到測(cè)序文庫。最后利用高通量測(cè)序儀HiseqX TEH連續(xù)雙向測(cè)序（平均測(cè)序深度不低于100×），用FASTX-Toolkit軟件讀出原始測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.2.3 序列分析:首先對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，去除低質(zhì)量及被污染的測(cè)序數(shù)據(jù)，隨后用Burrows Wheeler Aligner（BWA）軟件進(jìn)行序列比對(duì)（比對(duì)參照hg19），同時(shí)評(píng)價(jià)序列捕獲效果，用GATK軟件和VarScan軟件分別進(jìn)行單核苷酸變異（SNP）和插入缺失（InDel）查詢，得到目標(biāo)區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果，發(fā)現(xiàn)可疑的變異位點(diǎn)。在可疑的變異位點(diǎn)中去除內(nèi)含子區(qū)變異，并在EXAC數(shù)據(jù)庫（http://exac.broadinstitute.org）、1 000 human genome數(shù)據(jù)庫（http://www.internationalgenome.org/data）中過濾頻率大于1%的變異位點(diǎn)，添加HGMD數(shù)據(jù)庫（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac）、OMIM數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org）的相關(guān)注釋信息，最后應(yīng)用SIFT（http://sift.jcvi.org）、PolyPhen-2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2）、Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org）軟件對(duì)基因突變位點(diǎn)的致病性進(jìn)行分析，使用ExPASy（https://www.expasy.org）軟件預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，以美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）發(fā)布的《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》（2015）對(duì)發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)進(jìn)行分類。

1.2.4 Sanger測(cè)序驗(yàn)證:采用ABI 3730測(cè)序儀驗(yàn)證高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)致病性突變，根據(jù)突變所在位置，在其上、下游設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物。通過電泳確認(rèn)PCR反應(yīng)后，對(duì)片段進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件讀取，并與NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中的基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析，同時(shí)驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果與Sanger測(cè)序結(jié)果一致性。

2 結(jié)果

2.1 CGH檢測(cè)本研究首先利用CGH技術(shù)檢測(cè)先證者胎兒是否存在致病性拷貝數(shù)變異、雜合性缺失或單親二倍體。結(jié)果顯示先證者胎兒染色體不存在上述3種致病性染色體異常，見圖2。

圖2 先證者染色體微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果

2.2 WES檢測(cè)采用全外顯子測(cè)序?qū)ο茸C者胎兒組織的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，先證者存在CC2D2A（NM_001080522）:c.3964C＞T（p.Q1322X）和c.4567T＞C（p.C1523R）復(fù)合雜合突變，見表1。

2.3 突變位點(diǎn)的功能預(yù)測(cè)c.3964C＞T（p.Q1322X）為無義突變，該突變可將編碼CC2D2A蛋白中第1 322號(hào)位置谷氨酰胺的密碼子（CAG）變?yōu)榻K止密碼子（TAG），從而導(dǎo)致編碼蛋白提前終止，產(chǎn)生截短蛋白或蛋白被降解；該突變?cè)谌巳褐邪l(fā)生頻率極低（ExAC、HGMD、ClinVar數(shù)據(jù)庫均未見收錄）；Polyphen、SIFT、MutationTaster軟件預(yù)測(cè)可能影響蛋白功能尚未見此變異在患者中檢出的文獻(xiàn)報(bào)道。根據(jù)《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》（2015）將其評(píng)級(jí)為致?。≒VS1+2*PP）。

c.4567T＞C（p.C1523R）的變異描述和上面相似，SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster軟件對(duì)該變異的致病性進(jìn)行分析，結(jié)果均提示該突變有害；ExAC、HGMD數(shù)據(jù)庫未見收錄。根據(jù)《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》（2015）將其評(píng)級(jí)為可能致病（2*PM+2*PP）。

2.4 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證在發(fā)現(xiàn)先證者中存在CC2D2A基因（NM_001080522）的c.3964C＞T（p.Q1322X）和c.4567T＞C（p.C1523R）突變后，在先證者的父母及其姐妹中檢測(cè)是否存在上述突變。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，先證者的母親攜帶CC2D2A基因c.3964C＞T（p.Q1322X）突變的雜合變異。先證者父親攜帶c.4567T＞C（p.C1523R）雜合變異。見圖3。因此先證者所攜突變分別遺傳自父母雙方。

表1 先證者CC2D2A基因變異分析結(jié)果

3 討論

Meckel綜合征為一種罕見的致死性常染色體隱性遺傳病，于1969年Opitz和Howe首次描述了Meckel綜合征的臨床特征[4]。該綜合征的表型包括囊性腎發(fā)育不良、枕部腦膨出或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常以及多指（趾）畸形，此3 種表型也是確診Meckel綜合征的主要標(biāo)準(zhǔn)，臨床上，孕11～14周常規(guī)超聲檢查發(fā)現(xiàn)2種及以上典型的Meckel綜合征表型時(shí)，即可明確診斷疾病。本研究中，先證者胎兒表現(xiàn)出了腦膨出和多囊腎異常，符合Meckel綜合征的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，可診斷為Meckel綜合征。

圖3 家系成員CC2D2A 基因Sanger測(cè)序結(jié)果

此外，Meckel綜合征與一些綜合征的臨床表型相互重疊，如13-三體綜合征、Bardet-Biedl綜合征等，臨床上需要進(jìn)行鑒別。13-三體綜合征會(huì)出現(xiàn)心血管畸形及眼部異常，而很少出現(xiàn)肝纖維化；Bardet-Biedl綜合征中不會(huì)出現(xiàn)腦膨出的癥狀[5]；Joubert綜合征中的典型癥狀是視網(wǎng)膜發(fā)育不良及舌組織腫瘤[6]。這些綜合征除了臨床表現(xiàn)與Meckel綜合征相互重疊以外，在患者基因組中也發(fā)現(xiàn)了類似Meckel綜合征的基因突變，因此從遺傳學(xué)角度講可能屬于同一類疾病。Meckel綜合征具有高度的遺傳異質(zhì)性，目前已知可導(dǎo)致Meckel綜合征的致病基因有7個(gè)（MKS1、TMEM216、TMEM67、CEP290、RPGRIP1L、CC2D2A、NPHP3），分別位于不同的染色體上（17q22，11q13，8q22.1，12q21.32，16q12.2，4p15.32，3q22.1），并對(duì)應(yīng)1～7型Meckel綜合征。因此，基因診斷也是確診Meckel綜合征的重要手段。通過影像學(xué)方法發(fā)現(xiàn)胎兒異常，高度懷疑為Meckel綜合征的，可收集胎兒及父母雙方的樣本提取DNA，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析與Meckel綜合征相關(guān)的重要基因，對(duì)可疑的遺傳突變采用Sanger測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證，可明確遺傳病因并確定家系遺傳關(guān)系。2008年首次發(fā)現(xiàn)Meckel綜合征患者中存在CC2D2A基因的突變，在已報(bào)道的Meckel綜合征患者中，CC2D2A基因突變的占比約為13%。對(duì)于Meckel綜合征的致病機(jī)制，研究認(rèn)為與細(xì)胞纖毛功能異常有關(guān)。纖毛是一種多見于脊椎動(dòng)物細(xì)胞的突起結(jié)構(gòu)，分布于除白細(xì)胞外的所有細(xì)胞表面，具有高度保守性，在細(xì)胞遷移和胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上發(fā)揮重要作用。TALLILA等[7]通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，CC2D2A基因突變患者的成纖維細(xì)胞中缺乏纖毛，證實(shí)了CC2D2A基因在纖毛形成中的關(guān)鍵作用。該基因發(fā)生突變可導(dǎo)致諸如微管形成、囊泡運(yùn)輸以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列過程發(fā)生障礙的風(fēng)險(xiǎn)增加。同時(shí)，我們已知，CC2D2A基因位于人類4號(hào)染色體上，長(zhǎng)131 692 bp，包含38個(gè)外顯子，編碼的蛋白質(zhì)中含有一個(gè)卷曲螺旋狀的鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域在物種間高度保守，參與鈣信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)CC2D2A蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中會(huì)高度表達(dá)，其功能的缺失可導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育異常，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[8]。本研究發(fā)現(xiàn)的c.3964C＞T（p.Q1322X）導(dǎo)致編碼谷氨酰胺的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，使蛋白翻譯提前終止，氨基酸序列不完整，從而使蛋白功能喪失，進(jìn)而影響了纖毛功能及鈣信號(hào)通路，因此可能導(dǎo)致了Meckel綜合征的發(fā)病。

根據(jù)Meckel綜合征的分型和全外顯子高通量測(cè)序結(jié)果，我們認(rèn)為，該先證者是由CC2D2A基因突變引起的6型Meckel綜合征。本研究發(fā)現(xiàn)，該先證者胎兒攜帶CC2D2A基因c.3964C＞T（p.Q1322X）和c.4567T＞C（p.C1523R）意義不明的復(fù)合雜合變異。在先證者母親和父親中分別發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了CC2D2A基因c.3964C＞T（p.Q1322X）、c.4567T＞C（p.C1523R）的雜合突變。同時(shí)，在先證者姐姐中也發(fā)現(xiàn)了該基因的雜合突變，此結(jié)果提示先證者中所含有的突變來源于父母，并非新發(fā)突變。CC2D2A基因c.3964C＞T（p.Q1322X）突變是一種提前終止突變，該突變?cè)贓XAC數(shù)據(jù)庫和1000 human genome數(shù)據(jù)庫中的出現(xiàn)頻率均為0.0 001；c.4567T＞C（p.C1523R）為意義不明突變位點(diǎn)，該突變?cè)贓XAC數(shù)據(jù)庫和1000 human genome數(shù)據(jù)庫中未有收錄。SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster軟件預(yù)測(cè)該位點(diǎn)突變均為有害。因此，我們認(rèn)為CC2D2A基因c.3964C＞T（p.Q1322X）和c.4567T＞C（p.C1523R）意義不明復(fù)合雜合變異是該家系先證者患病的遺傳因素。此外，我們?cè)谖墨I(xiàn)和數(shù)據(jù)庫檢索中未見該變異的相關(guān)報(bào)道，因此，本研究在臨床上首次發(fā)現(xiàn)了CC2D2A 基因c.3964C＞T（p.Q1322X）和c.4567T＞C（p.C1523R）意義不明復(fù)合雜合突變與Meckel綜合征的聯(lián)系。通過對(duì)Meckel綜合征一個(gè)相關(guān)家系的臨床及遺傳學(xué)分析明確了Meckel綜合征的臨床和基因診斷信息，CC2D2A基因變異很可能是該Meckel綜合征患病家系的致病原因，但仍需通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí)。此外，該研究重點(diǎn)對(duì)于已發(fā)現(xiàn)的遺傳病致病基因進(jìn)行篩查，并不能完全排除其他少見或目前未發(fā)現(xiàn)的致病基因?qū)е翸eckel綜合征的可能性。我們的發(fā)現(xiàn)對(duì)于Meckel綜合征的確診及家系遺傳咨詢，進(jìn)一步探索其發(fā)病機(jī)制、表型-基因型相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)治療靶點(diǎn)及指導(dǎo)臨床工作具有重要意義。

生育過Meckel綜合征患兒的夫婦再次生育時(shí)的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為25%。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并明確先證者患兒致病原因可為夫婦再次生育提供指導(dǎo)，減少出生缺陷兒的出生。胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是遺傳性出生缺陷的源頭阻斷技術(shù)。本研究的家系中先證者的致病變異及來源明確，據(jù)此可采用PGD技術(shù)阻斷該致病變異在家系中的世代遺傳。

臨床上，患有遺傳綜合征的胎兒通常表現(xiàn)出超聲結(jié)構(gòu)異常，由于存在遺傳異質(zhì)性，相同的臨床表型可能由不同的致病基因突變所致。綜合其他研究及本研究的結(jié)果，基于二代測(cè)序的WES檢測(cè)已成為對(duì)此類胎兒進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)的重要策略。