劉潔瓊 曹永清 李科

[摘要] 目的 探討2-甲氧雌二醇（2-ME2）對(duì)鼻咽癌干細(xì)胞增殖、遷移及放療抵抗性的影響。 方法 選取鼻咽癌CNE-2細(xì)胞構(gòu)建鼻咽干細(xì)胞模型，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為0 μmol/L組、4 μmol/L組和8 μmol/L組。采用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，采用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移情況，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放療抵抗性，采用Western blot檢測(cè)核因子-κB（NF-κB）p65和低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）蛋白表達(dá)。 結(jié)果 4 μmol/L組和8 μmol/L組細(xì)胞OD值明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細(xì)胞OD值明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。4 μmol/L組和8 μmol/L組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于4 μmol/L組（P < 0.05）。4 μmol/L組和8 μmol/L組細(xì)胞0、8 Gy照射后克隆形成能力明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細(xì)胞0、8 Gy照射后克隆形成能力明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。4 μmol/L組和8 μmol/L組細(xì)胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達(dá)明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細(xì)胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達(dá)明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。 結(jié)論 2-ME2能抑制鼻咽癌干細(xì)胞增殖及遷移能力，同時(shí)降低其放療抵抗性，機(jī)制可能與其抑制HIF-1/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 2-甲氧雌二醇;鼻咽癌;增殖;遷移;放療抵抗性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R739.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）08（b）-0110-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of 2- methoxyestradiol （2-ME2） on proliferation， migration and resistance to radiotherapy in nasopharyngeal carcinoma stem cells. Methods Nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells were selected to construct nasopharyngeal stem cell model， they were randomly divided into 0 μmol/L group， 4 μmol/L group and 8 μmol/L group by using random number table method. The proliferation of cells in each group was detected by CCK-8 cell proliferation test， Transwell cell migration test was used to detect the cell migration in each group， clonogenic assay was used to detect cell radiotherapy resistance， Western blot method was used to detect the expression of nuclear factor-k-gene-binding （NF-κB） p65 and hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） protein. Results OD value of cells in 4 μmol/L group and 8 μmol/L group was significantly lower than that in 0 μmol/L group （P < 0.05）， and that in 8 μmol/L group was significantly lower than that in 4 μmol/L group （P < 0.05）. The number of perforating cells in 4 μmol/L group and 8 μmol/L group was significantly less than that in 0 μmol/L group （P < 0.05）; the number of perforating cells in 8 μmol/L group was significantly less than that in 4 μmol/L group （P < 0.05）. The colony-forming ability of cells in 4 μmol/L group and 8 μmol/L group after 0 and 8 Gy irradiation was significantly lower than that in 0 μmol/L group （P < 0.05）; the colony-forming ability of cells in 8 μmol/L group after 0 and 8 Gy irradiation was significantly lower than that in 4 μmol/L group （P < 0.05）. The expression of NF-κB p65 and HIF-1α in 4 μmol/L group and 8 μmol/L group was significantly lower than that in 0 μmol/L group （P < 0.05）; the expression of NF-κB p65 and HIF-1α in 8 μmol/L group was significantly lower than that in 4 μmol/L group （P < 0.05）. Conclusion 2-ME2 can inhibit the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma stem cells， and reduce the radiation resistance， the mechanism may be related to the inhibition of HIF-1/NF-κB signal transduction pathway， it is worthy of further study.

[Key words] 2-methoxy estradiol; Nasopharyngeal carcinoma; Proliferation; Migration; Radiotherapy resistance

鼻咽癌是五官科常見(jiàn)的癌癥之一，我國(guó)南方是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病因素可能與環(huán)境氣候有關(guān)[1]。對(duì)于鼻咽癌，臨床上目前有多種治療方法，但手術(shù)過(guò)程繁瑣，患者預(yù)后不佳，有研究創(chuàng)新性地應(yīng)用2-甲氧雌二醇（2-ME2）基因調(diào)控的方式，通過(guò)抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞等干細(xì)胞增殖及遷移能力來(lái)治療鼻咽癌[2]，結(jié)果表明，其作用機(jī)制可能與2-ME2抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α/核因子-κB（HIF-1/NF-κB）信號(hào)通路有關(guān)。還有研究通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，采用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移情況，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放療抵抗性，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達(dá)[3]。本研究主要探討2-ME2對(duì)鼻咽癌干細(xì)胞增殖、遷移及放療抵抗性的影響，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，購(gòu)于中南大學(xué)腫瘤研究所;麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（型號(hào)：PM0800-250g，品牌：北京酷來(lái)搏科技有限公司）;離心機(jī)（型號(hào)：BenchMate C8，品牌：Oxford Lab Products）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建鼻咽癌CNE-2干細(xì)胞模型? 將CNE-2細(xì)胞放入瓊脂培養(yǎng)基中，并放入細(xì)胞保溫箱中進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，得到大量CNE-2細(xì)胞進(jìn)行凍存，以備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組? 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將構(gòu)建的CNE-2干細(xì)胞分為三組：①0 μmol/L組，培養(yǎng)液中僅加入8 μL二甲基亞砜（DMSO）;②4 μmol/L組，培養(yǎng)液中加入4 μL DMSO和4 μL 2-ME2（濃度4 μmol/L）;③8 μmol/L組，培養(yǎng)液中加入8 μL 2-ME2（濃度8 μmol/L）。

1.2.3 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)? 將三組細(xì)胞分別進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖，取凍存的CNE-2干細(xì)胞，按照15 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心分離，離心半徑10 cm，每?jī)珊辽齌rizol試劑裂解的樣品中加入0.4 mL的氯仿，進(jìn)行裂解操作，25℃水浴采用CCK-8細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)增殖，再次15 000 r/min離心10 min再培養(yǎng)，以檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力情況。

1.2.4 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)? 將三組細(xì)胞分別進(jìn)行Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)，取凍存的CNE-2干細(xì)胞，按照20 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心后應(yīng)用基質(zhì)膠鋪板后制備CNE-2干細(xì)胞懸液后檢測(cè)各組細(xì)胞遷移和侵襲情況。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)? 分別取三組細(xì)胞將細(xì)胞核取出后，與體細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)結(jié)合，進(jìn)行克隆培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)后，對(duì)三組細(xì)胞分別進(jìn)行放療照射，觀察細(xì)胞存活性。

1.2.6 Western blot檢測(cè)? 將三組細(xì)胞分別進(jìn)行Western blot檢測(cè)，將培養(yǎng)好的CNE-2干細(xì)胞放在兩塊干凈的玻璃平板之間離心后備用，將配制好的聚丙烯酰胺分離膠液體并脫氣，然后放入15%的過(guò)硫酸銨鈉和四甲基乙二胺，輕輕攪拌混勻。按所需分離的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，將以上兩種材料進(jìn)行充分混合后將分離好的CNE-2干細(xì)胞與混合液一起水浴40 min后進(jìn)行充分清洗，再將硝酸纖維素膜與CNE-2干細(xì)胞進(jìn)行混合后顯色以觀察NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖活力比較

4 μmol/L組和8 μmol/L組細(xì)胞OD值明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細(xì)胞OD值明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組細(xì)胞Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)比較

4 μmol/L組和8 μmol/L組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于4 μmol/L組（P < 0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

2.3 各組細(xì)胞照射后克隆形成能力比較

4 μmol/L組和8 μmol/L組細(xì)胞0、8 Gy照射后克隆形成能力明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細(xì)胞0、8 Gy照射后克隆形成能力明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。見(jiàn)表3、圖2。

2.4 各組細(xì)胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達(dá)比較

4 μmol/L組和8 μmol/L組細(xì)胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達(dá)明顯低于0 μmol/L組（P < 0.05）;8 μmol/L組細(xì)胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達(dá)明顯低于4 μmol/L組（P < 0.05）。見(jiàn)表4、圖3。

3 討論

鼻咽癌的病理病因目前認(rèn)為與三種因素有關(guān)，即遺傳因素、病毒因素（主要為EB病毒感染）和環(huán)境因素，對(duì)于鼻咽癌的治療臨床上方法很多，但治療效果都不確切，本研究主要從基因表達(dá)層面抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移。

2-ME2基因是一種近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的抑癌物質(zhì)，2-ME2在機(jī)體內(nèi)有抑制多種蛋白通路和鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的作用[4]，2-ME2可視為鼻咽癌的“抑癌基因”。2-ME2通過(guò)對(duì)CNE-2細(xì)胞上皮間充質(zhì)胚胎轉(zhuǎn)化后在鼻咽癌的疾病進(jìn)程中起到抑癌基因的作用，2-ME2能通過(guò)抑制鼻咽癌基因表達(dá)從而抑制鼻咽癌CNE-2干細(xì)胞的增值、轉(zhuǎn)移和侵襲[5]。本研究證實(shí)，2-ME2基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞CNE-2干細(xì)胞特性具有調(diào)控作用，并且證明了2-ME2能夠特異性調(diào)控鼻咽癌相關(guān)基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)其抑制鼻咽癌干細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果提示，可以將2-ME2作為抑制鼻咽癌治療藥物，療效確切。

本研究應(yīng)用2-ME2作用于鼻咽癌CNE-2細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。采用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，CCK-8是一種檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，檢測(cè)原理是CNE-2細(xì)胞RNA中的琥珀酸脫氫酶，能使外源性CCK-8細(xì)胞氧化還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在CNE-2干細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能[6]。當(dāng)細(xì)胞增殖時(shí)并不影響藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚存在于CNE-2干細(xì)胞中的數(shù)量，會(huì)隨著細(xì)胞增殖而分裂增多，伴隨在細(xì)胞質(zhì)中不斷裂解為更小的粒子，當(dāng)CNE-2干細(xì)胞增殖趨向最大化完成時(shí)，DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映CNE-2細(xì)胞增殖的數(shù)量[7]。在細(xì)胞數(shù)量處于可控的范圍內(nèi)時(shí)，CCK-8結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系[8]。CK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)法特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)，對(duì)于測(cè)量出細(xì)胞增殖的數(shù)量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

采用Transwell檢測(cè)各組CNE-2細(xì)胞遷移和侵襲，Transwell檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是指將CNE-2細(xì)胞放入培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中存在上下兩個(gè)小室，在本研究中上下兩個(gè)小室內(nèi)分別存有CNE-2細(xì)胞上下兩層的層培養(yǎng)液并以聚碳酸酯膜相隔[9]。應(yīng)用此膜可將CNE-2細(xì)胞在不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜上進(jìn)行細(xì)胞遷移、侵襲的研究[10-11]。

研究中需利用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞2-ME2蛋白表達(dá)，該方法是采用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，被檢測(cè)物是CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后的2-ME2基因蛋白[12-13]。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增RNA后，將轉(zhuǎn)錄后的2-ME2基因蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體如瓊脂膠體上，固相載體吸附蛋白質(zhì)后仍能保持電泳分離的2-ME2表達(dá)基因的活性[14]。鼻咽癌CNE-2干細(xì)胞誘導(dǎo)HIF-1/NF-κB信號(hào)通路由聯(lián)級(jí)放大反應(yīng)活化絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，該聯(lián)級(jí)反應(yīng)可放大鼻咽癌組織電生物信號(hào)，控制細(xì)胞相關(guān)的生命活動(dòng)，促進(jìn)鼻咽癌增殖和遷移。該通路主要由兩種蛋白組成，分別是NF-κB p65和HIF-1α蛋白。有大量研究[15-17]顯示，當(dāng)細(xì)胞過(guò)度表達(dá)NF-κB p65上游激活因子時(shí)，能夠激活鼻咽癌干細(xì)胞增殖遷移能力，抵御外界進(jìn)行放療時(shí)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞造成損傷，促進(jìn)鼻咽癌損傷癌細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)。HIF-1是鼻咽癌HIF-1/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡都起著非常重要的調(diào)控作用，它能誘導(dǎo)鼻咽癌干細(xì)胞加速分化[18]，對(duì)放射治療能做出防御反應(yīng)[19-20]。

本研究結(jié)果顯示，2-ME2濃度越高，CNE-2干細(xì)胞增殖能力越低，說(shuō)明2-ME2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有明顯的殺傷抑制作用。2-ME2濃度越高，CNE-2干細(xì)胞遷移效率越低，說(shuō)明2-ME2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞起到抑制作用，并使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力下降。2-ME2濃度越高，CNE-2干細(xì)胞克隆程度越低，說(shuō)明2-ME2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有明顯殺傷作用，阻止CNE-2干細(xì)胞克隆繁殖。2-ME2濃度越高，CNE-2干細(xì)胞對(duì)NF-κB p65、HIF-1α蛋白表達(dá)有明顯抑制作用，說(shuō)明2-ME2能抑制HIF-1/NF-κB信號(hào)通路，增加放療的敏感性。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于，應(yīng)用2-ME2有效抑制鼻咽癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制相關(guān)蛋白表達(dá)，并增加放療敏感性。

綜上所述，2-ME2能抑制鼻咽癌干細(xì)胞增殖及遷移能力，同時(shí)降低其放療抵抗性，機(jī)制可能與其抑制HIF-1/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-12-19? 本文編輯：李亞聰）