朱珂 婁利霞 祁軼斐

[摘要] 目的 通過(guò)觀察扶正化瘀方（FZHY）對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞（CFs）細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）代謝的影響，探討其抗心肌纖維化（MF）的分子機(jī)制。 方法 差速貼壁法提取乳鼠原代CFs，傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞分為3組，每組6個(gè)樣本，分別加入2% FBS-DMEM（空白對(duì)照組），1×10-7mol/L AngⅡ（AngⅡ組），1×10-7mol/L AngⅡ+100 μg/mL FZHY（FZHY組）。干預(yù)48 h后，采用ELISA法檢測(cè)Ⅰ型膠原（ColⅠ）、ColⅢ、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的分泌情況;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)ColⅠ、ColⅢ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組ColⅠ、ColⅢ含量及mRNA的表達(dá)增加（P < 0.01）;與AngⅡ組比較，F(xiàn)ZHY組ColⅠ、ColⅢ含量及其mRNA表達(dá)下降（P < 0.05或P < 0.01）。與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2及其mRNA表達(dá)增加（P < 0.05），MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1有降低趨勢(shì);與AngⅡ組比較，F(xiàn)ZHY組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2及其mRNA表達(dá)下降，MMP-2/TIMP-2降低（P < 0.05或P < 0.01），MMP-9/TIMP-1有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 FZHY可減少CFs ColⅠ、ColⅢ的表達(dá)，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2及其mRNA表達(dá)，降低MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值，調(diào)控ECM代謝有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 扶正化瘀方;心肌纖維化;心肌成纖維細(xì)胞;細(xì)胞外基質(zhì);金屬基質(zhì)蛋白酶

[中圖分類號(hào)] R541? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）08（b）-0012-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Fuzheng Huayu Recipe （FZHY） on the extracellular matrix （ECM） metabolism of rat cardiac fibroblasts （CFs） induced by angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ）， and to explore the mechanism of FZHY in treating myocardial fibrosis. Methods Differential adherent method was used to extract primary CFs from neonatal rats and subculture them. Cells can be divided into three groups， each group of 6 samples， add 2% FBS-DMEM （blank control group）， 1 × 10-7 mol/L Ang Ⅱ （Ang Ⅱ group）， 1 × 10-7 mol/L Ang Ⅱ + 100 μg/mL FZHY （FZHY group）. Intervention after 48 h， collagentype Ⅰ（ColⅠ）， ColⅢ， matrix metalloproteinases （MMP）-2， MMP-9 and TIMP-1 and TIMP-2 secretion were detected by the method of ELISA; ColⅠ， ColⅢ， MMP-2 and MMP-9 and TIMP 1 and TIMP-2 mRNA expression were detected by real-time fluorescent quantitative PCR method. Results Compared with blank control group， Col Ⅰ， Col Ⅲ content and mRNA expression of Ang Ⅱ group increased （P < 0.01）. Compared with Ang Ⅱ group， Col Ⅰ， Col Ⅲ content and its mRNA of FZHY group expression decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with blank control group，? MMP-2， MMP-9 and TIMP 1 and TIMP-2 and its mRNA expression of Ang Ⅱ group increased （P < 0.05）. MMP-2/TIMP-2 and MMP-9/TIMP-1 showed a decreasing trend. Compared with Ang Ⅱ group， MMP-2， MMP-9 and TIMP 1 and TIMP-2 and its mRNA expression， and its MMP-2/TIMP-2 of FZHY group decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and MMP-9/TIMP-1 had a tendency to decrease， but there was no statistical significance （P > 0.05）. Conclusion FZHY can reduce the CFs ColⅠ， ColⅢ expression， its mechanism may be related to downgrade MMP-2， MMP-9 and TIMP 1 and TIMP-2 and its mRNA expression， reduce the MMP-2/TIMP-2， MMP-9/TIMP-1 ratio， regulating the metabolism of ECM.

[Key words] Fuzheng Huayu Recipe; Myocardial fibrosis; Myocardial fibroblast; Extracellular matrix; Metalloproteinase

心肌纖維化（MF）是由心肌成纖維細(xì)胞（CFs）增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成與降解失衡所導(dǎo)致的病理改變[1-2]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是調(diào)控ECM代謝的重要酶系[3]，MMPs及其組織抑制劑（TIMPs）比例失衡導(dǎo)致的ECM代謝紊亂是MF的重要原因之一[4]。前期研究證實(shí)，扶正化瘀方（FZHY）可改善MF[5-6]，但其具體的細(xì)胞分子機(jī)制尚不明確。本研究采用差速貼壁法提取乳鼠原代CFs，觀察FZHY對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的CFs基質(zhì)代謝的影響，探討其抗MF的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

3日齡Wistar乳鼠20只，雌雄不限，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)進(jìn)，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，合格證號(hào)：11400700277357。

1.2 試劑

Neonatal Heart Dissociation Kit（美天旎公司，貨號(hào)：130-098-373）;Vimentin抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：BM0135）;a-SMA抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：BM4172）;AngⅡ（中肽公司，貨號(hào)：CJ-04-01164）;ELISA試劑盒（Elisa Biotech公司，貨號(hào)：EIA-3504）;RNAprep pure Cell/Bacteria Kit（TIANGEN公司，貨號(hào)：DP430）;FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（TIANGEN公司，貨號(hào)：KR118-02）;SuperReal PreMix Plus（TIANGEN公司，貨號(hào)：FP205-02）。

扶正化瘀方由丹參8 g、蟲草4 g、桃仁2 g、絞股藍(lán)6 g、松花粉2 g、五味子2 g 六味中藥組成。本實(shí)驗(yàn)所用扶正化瘀方浸膏由上海黃海制藥有限責(zé)任公司提供，得膏率為13.75%，用2%FBS-DMEM稀釋1000倍后使用。

1.3 儀器

超凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體一廠）;二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)，Heraeus）;全自動(dòng)組織處理系統(tǒng)（美天旎公司）;紫外分光光度計(jì)（Pharmacia Biotech公司）;Agilent Mx3000P PCR儀（美國(guó)ABI）。

1.4 CFs的培養(yǎng)和鑒定

根據(jù)Neonatal Heart Dissociation Kit說(shuō)明書操作，無(wú)菌條件下取Wistar乳鼠心臟，采用差速貼壁法獲取CFs，實(shí)驗(yàn)用3～5代CFs，10%FBS-DMEM常規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察CFs形態(tài)，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行鑒定。

1.5 分組及處理

以7.5×104個(gè)/mL濃度接種CFs于6孔板中，每孔2 mL。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%，換無(wú)血清DMEM孵育24 h。分別加入2%FBS-DMEM（空白對(duì)照組），1×10-7mol/L AngⅡ（AngⅡ組），1×10-7mol/L AngⅡ+100 μg/mL FZHY（FZHY組）。干預(yù)48 h后，收集細(xì)胞上清及細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.6 ColⅠ、ColⅢ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2含量的檢測(cè)

采用ELISA法，取上清按試劑盒說(shuō)明書操作。在樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔中分別加入40 μL待測(cè)樣本和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品;每孔加入100 μL抗體，37℃孵育1 h;吸棄殘液，加入底物A、B各50 μL，37℃避光15 min;加入50 μL終止液，在450 nm處測(cè)定各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

1.7 ColⅠ、ColⅢ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。根據(jù)RNAprep pure Cell/Bacteria Kit、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix說(shuō)明書操作提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15 min，95℃ 變性10 s，60℃退火-延伸32 s共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參。所得CT值按照2-△△ct的方法，進(jìn)行均一化處理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見(jiàn)表1。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性采用單因素方差分析，總體有差異用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較，不滿足方差齊性用Welch法及Dunnett′s T3法進(jìn)行多重比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFs的鑒定

顯微鏡下觀察，CFs生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞多呈梭形或三角形，折光性弱，無(wú)自發(fā)搏動(dòng)。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果顯示，Vimentin染色呈陽(yáng)性，a-SMA染色呈陰性。細(xì)胞純度達(dá)95%以上。

2.2 各組對(duì)ColⅠ、ColⅢ含量的影響

與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組ColⅠ、ColⅢ含量增加（P < 0.01）;與AngⅡ比較，F(xiàn)ZHY組ColⅠ、ColⅢ含量減少（P < 0.01或P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組對(duì)ColⅠ、ColⅢ mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組ColⅠ、ColⅢ mRNA表達(dá)水平升高（P < 0.01）;與AngⅡ比較，F(xiàn)ZHY組ColⅠ、ColⅢ mRNA表達(dá)水平下降（P < 0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組對(duì)MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表達(dá)及MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的影響

與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2含量增加（P < 0.01），MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1有下降趨勢(shì);與AngⅡ比較，F(xiàn)ZHY組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量以及MMP-2/TIMP-2減少（P < 0.05或P < 0.01），MMP-9/TIMP-1有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 各組對(duì)MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，AngⅡ組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA表達(dá)水平升高（P < 0.05）;與AngⅡ比較，F(xiàn)ZHY組MMP-2、MMP-9、TIMP1和TIMP2 mRNA表達(dá)水平下降（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)表5。

3 討論

FZHY由丹參、桃仁、五味子、絞股藍(lán)、蟲草、松花粉組成，具有活血化瘀，益氣扶正的功效。前期研究[7]顯示，MF過(guò)程中同樣存在成纖維細(xì)胞增殖，ECM合成降解失衡的病理及正虛血瘀的病機(jī)。在“異病同治”理論指導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY可抑制心肌膠原表達(dá)，改善心梗后MF[8]。

ECM主要由ColⅠ、ColⅢ組成[9]，其過(guò)度沉積是MF形成的重要原因[5]。CFs是合成ColⅠ、ColⅢ的主要場(chǎng)所，某些病理?xiàng)l件刺激下，CFs過(guò)度增殖并大量分泌ColⅠ、ColⅢ[10]，導(dǎo)致ECM合成增多，心肌僵硬度增加，MF發(fā)生[11]。AngⅡ通過(guò)激活CFs的AT1-R，影響CFs增殖和膠原表達(dá)[12]。故本研究采用AngⅡ建立CFs的MF細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，AngⅡ可誘導(dǎo)CFs的ColⅠ、ColⅢ表達(dá)升高，經(jīng)FZHY處理后其表達(dá)明顯降低，提示FZHY可通過(guò)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs膠原表達(dá)，減少ECM沉積，改善MF。

MF形成不僅包括ECM合成增多，還包括ECM降解失衡及膠原網(wǎng)絡(luò)破壞等[13]。MMPs是一組由CFs等分泌，參與ECM降解與破壞的蛋白水解酶家族[14]。MMPs不僅能直接降解ECM并活化其他類型MMPs產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)[15]，還能調(diào)節(jié)膠原的合成，使正常膠原被缺乏連接結(jié)構(gòu)的纖維間質(zhì)代替[16-17]。MMP-2和MMP-9是其重要成員，過(guò)量表達(dá)可破壞膠原網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)CFs增殖、分化及遷移，致ECM沉積和MF形成[18-19]。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，以1∶1的比例與MMPs形成復(fù)合體，阻斷MMPs與底物結(jié)合，抑制其活性[20]。TIMP-2與MMP-2，TIMP-1與MMP-9能分別形成酶原復(fù)合物，其比例失衡可促進(jìn)MF的發(fā)展[21]。結(jié)果顯示，AngⅡ組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表達(dá)升高，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1有升高趨勢(shì)，提示AngⅡ誘導(dǎo)了CFs MMP-2、MMP-9表達(dá)的相對(duì)升高，使ECM代謝紊亂，促進(jìn)了MF發(fā)展。經(jīng)FZHY干預(yù)后，CFs的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表達(dá)及MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值降低，提示FZHY可通過(guò)降低CFs的MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1水平，調(diào)控ECM代謝平衡，改善MF。

本研究從ECM代謝角度探討了FZHY抗MF的細(xì)胞分子機(jī)制，證實(shí)FZHY可減少CFs ColⅠ、ColⅢ的表達(dá)，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2及其mRNA表達(dá)，降低MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1，調(diào)控ECM代謝有關(guān)。研究結(jié)果為FZHY治療MF提供了新的理論依據(jù)。然而MF的分子機(jī)制復(fù)雜，纖維化過(guò)程中ECM代謝還受TGF-β、非編碼RNA等眾多因素的調(diào)控。今后我們將在這些方面做進(jìn)一步探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 朱錦星，凌望，程大雁，等.中藥干預(yù)心臟成纖維細(xì)胞活化防治心肌纖維化研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2018，29（8）：1971-1974.

[2]? 馬金，丁春華.心臟成纖維細(xì)胞與心肌纖維化[J].中華心血管病雜志，2014，42（3）：269-272.

[3]? López B，González A，Díez J. Role of matrix metalloproteinases in hypertension-associated cardiac fibrosis [J]. Curr Opin Nephrol Hypertens，2004，13（2）：197-204.

[4]? 馬雙陶，楊大春，唐兵，等.白藜蘆醇抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抗酒精性心肌纖維化[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2012，20（1）：21-24.

[5]? 祁軼斐，任學(xué)嬌，婁利霞，等.FZHY對(duì)心肌梗死后心肌纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)代謝的影響[J].中醫(yī)雜志，2018， 59（7）：607-611.

[6]? 任學(xué)嬌，祁軼斐，婁利霞，等.FZHY對(duì)心肌梗死大鼠心肌纖維化及TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2018，16（9）：1185-1189.

[7]? 吳愛(ài)明，趙明鏡，張冬梅，等.心梗后心力衰竭模型大鼠中醫(yī)證候特點(diǎn)及心臟的超聲評(píng)價(jià)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27（3）：227-230.

[8]? 吳愛(ài)明，翟建英，張冬梅，等.扶正化瘀膠囊對(duì)心肌梗死大鼠心肌纖維化的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（14）：2618-2621.

[9]? 卓小楨，劉懿，李娜，等.白藜蘆醇通過(guò)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路抑制心肌成纖維細(xì)胞中AngⅡ誘導(dǎo)的Ⅰ/Ⅲ型膠原合成[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2018，39（4）：525-529，557.

[10]? 于婷，王小梅.通心絡(luò)對(duì)高糖培養(yǎng)下心肌成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，47（2）：132-136.

[11]? Tang M，Zhong M，Shang Y，et al. Differential regulation of collagen typesⅠandⅢexpression in cardiac fibroblasts by AGEs through TRB3/MAPK signaling pathway [J]. Cell Mol Life Sci，2008，65（18）：2924-2932.

[12]? Chi JY，Wang L，Zhang XH，et al. Activation of calcium-sensing receptor-mediated autophagy in angiotensinII-induced cardiac fibrosis in vitro [J]. Biochem. Biophys. Res. Commun.，2018，497（2）：571-576.

[13]? 劉軍鋒，賈克剛，劉運(yùn)德.基質(zhì)金屬蛋白酶與心臟重構(gòu)及心肌病理?yè)p害的研究進(jìn)展[J].中華老年心腦血管病雜志，2007，9（7）：499-500.

[14]? 王娟，程志清.基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑與病毒性心肌炎心肌纖維化[J].中國(guó)心血管雜志，2007（06）：467-469.

[15]? Trim JE，Samra SK，Arthur MJ，et al. Upstream tissue inhibitor of metalloproteinases-1 （TIMP-1） element-1，a novel and essential regulatory DNA motif in the human TIMP-1 gene promoter，directly interacts with a 30-kDa nuclear protein [J]. J Biol Chem，2000，275（9）：6657-6663.

[16]? 陳漫天，魏盟.心室重構(gòu)中細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失平衡的研究進(jìn)展[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，25（3）：261-264.

[17]? Briest W，H？觟lzl A，Rassler B，et al. Significance of matrix metalloproteinases in norepinephrine-induced remodelling of rat hearts [J]. Cardiovasc Res，2003，57（2）：379-387.

[18]? Dong J，Gao C，Liu J，et al. TSH inhibits SERCA2a and thePKA/PLN pathway in rat cardiomyocytes [J]. Oncotarget，2016，7（26）：39 207-39 215.

[19]? Gao C，Li T，Liu J，et al. Endothelial Functioning and HemodynamicParameters in Rats with Subclinical Hypothyroid and the Effects ofThyroxine Replacement [J]. PLoS One，2015，10（7）：1-14.

[20]? Fan D，Takawale A，Basu R，et al. Differential role of TIMP2 and TIMP3 in cardiac hypertrophy，fibrosis and diastolic dysfunction [J]. Cardiovasc Res，2014，103（2）：268-280.

[21]? 劉焱，劉剛，劉坤申.基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑與心臟疾病[J].臨床薈萃，2005，20（16）：953-955.

（收稿日期：2018-01-08? 本文編輯：封? ?華）