王蕊蕊，胡 穎，楊振德,2，郭春暉，彭 欣，鄭霞林，張海歐

（1.廣西大學林學院，南寧 530004；2.廣西森林生態(tài)與保育重點實驗室，南寧 530004；3.廣西大學農(nóng)學院，南寧 530004；4.攀枝花市森林病蟲防治檢疫站，四川攀枝花 617000）

桉樹枝癭姬小蜂（Leptocybe invasa），屬于膜翅目（Hymenoptera），小蜂總科（Chalcidoidea），姬小蜂科（Eulophidae），是嚴重危害桉屬植物枝葉的致癭性害蟲[1]。該害蟲起源于澳大利亞，最早于2000年在中東和地中海地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已擴散至亞洲、歐洲、非洲、美洲及大洋洲的45 個國家，給桉樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2]。目前，國內(nèi)外對桉樹枝癭姬小蜂的研究主要集中在生物學、生態(tài)學、生理學和綜合治理等方面[3-4]，對桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的研究鮮有報道。

昆蟲體內(nèi)棲居著種類繁多、數(shù)量巨大的微生物群落，這些微生物與宿主昆蟲在長期協(xié)同進化過程中，形成了豐富多樣的種群結(jié)構(gòu)和生物學功能，對宿主的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、生殖、行為、抗性等方面都產(chǎn)生了顯著的影響，同時在害蟲的防控、昆蟲資源的利用及生物能源的生產(chǎn)等領域具有較大的應用潛力[5-7]。隨著現(xiàn)代分子生物技術的快速發(fā)展和應用，16S rDNA 基因序列分析技術、DGGE 技術、高通量測序技術和宏基因組學等已成為研究微生物較常用的方法，并得到了較傳統(tǒng)微生物分離鑒定法更為全面、準確的菌群結(jié)構(gòu)信息，但不能解析哪些菌為可培養(yǎng)或不可培養(yǎng)細菌，若想用生物學試驗驗證體內(nèi)細菌對宿主的生理功能和生態(tài)作用及開發(fā)利用體內(nèi)細菌資源，仍需借助傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法。本研究運用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和16S r DNA 基因測序相結(jié)合的方法從夏季剛羽化的桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內(nèi)分離細菌，研究其體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的種類組成，為后期探討體內(nèi)可培養(yǎng)細菌對桉樹枝癭姬小蜂的作用提供菌株材料，進而為利用體內(nèi)細菌開發(fā)新的生物防控技術奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

試蟲采自廣西大學林學院教學實踐基地（108°17′E，22°51′N）網(wǎng)棚中單株栽培的巨園桉（Eucalyptus grandis×E.tereticornis）DH201-2 植物上夏季剛羽化的桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲。

1.2 可培養(yǎng)細菌的分離培養(yǎng)

參照劉寧等[8]的方法略有改進，將20頭桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲在無菌的條件下用75%的酒精和1‰HgCl2消毒后，加1 mL 無菌水研磨成菌液，按照10 倍梯度稀釋法制成10-1～10-5不同濃度的菌液并均勻涂于NA 培養(yǎng)基平板內(nèi)，每個濃度重復5次，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)72 h；挑取大小、顏色、形態(tài)等不同的菌落在NA培養(yǎng)基平板上進行四區(qū)劃線純化培養(yǎng)，將純化后的菌株接種于NA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 可培養(yǎng)細菌16S rDNA 基因的擴增

采用Biospin 細菌基因組DNA 提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）分別提取各細菌基因組DNA。使用細菌通用引物：27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1 492 R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）進行PCR 擴增。擴增體系：2 × EayTaqPCR SuperMix（+dye）（北京全式金生物技術有限公司）15 μL，ddH2O 12 μL，27 F（32 P）和1 492 R（32 P）各0.5 μL，DNA模板2 μL。反應條件：95 ℃5 min；（94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min）× 35 個 循 環(huán)，72 ℃10 min，4 ℃保溫。用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測PCR 擴增產(chǎn)物，并使用膠回收試劑盒進行回收純化后送至北京睿博興科生物技術有限公司測序。

1.4 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序結(jié)果在EzBioCloud （http：∕∕www.ezbiocloud.net∕eztaxon）進行比對，并結(jié)合RDP Classifier在線分析，選取各菌株的同源序列，采用ClustalX程序進行匹配比對，使用MEGA 5.0 軟件中的Neighbor-Joining（NJ）法bootstrap 置信度1 000 次構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[9-10]，依此來確定各菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細菌的分離純化

利用NA培養(yǎng)基分離夏季桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內(nèi)可培養(yǎng)細菌，根據(jù)形態(tài)、顏色等特征共獲得17株不同的細菌（表1）。

2.2 菌株16S rDNA擴增及序列分析結(jié)果

以提取的上述17 株不同的細菌基因組DNA 為模板擴增16S rDNA基因，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，16S rDNA 基因片段大小均在1 500 bp 左右（圖1）。將測序得到的17 條序列在EzBioCloud（http：∕∕www.ezbiocloud.net∕eztaxon）進行同源性比對，并結(jié)合RDP 數(shù)據(jù)庫Classifier 分析發(fā)現(xiàn)，從夏季桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)分離的17 株細菌分屬于厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），共涉及15個屬，其中3株（DH10、DH11、DH12）屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），DH1 屬于葡萄球 菌屬（Staphylococcus），DH2屬于泛菌屬（Pantoea），DH3屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），DH4屬于類諾卡氏屬（Nocardioides），DH5屬于不動桿菌屬（Acinetobacter），DH6屬于壤球菌屬（Agrococcus），DH7 屬于微桿菌屬（Microbacterium），DH8 屬于短小桿菌屬（Curto-bacterium），DH9 屬于寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），DH13屬于根瘤菌屬（Rhizobium），DH14 屬于Dyadobacter屬，DH15 屬于金黃桿菌屬（Chryseobacterium）， DH16 屬于短狀桿菌屬（Brachybacterium），DH17 屬于微球菌屬（Micrococcus）（表2）。

表1 夏季桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的菌落特征Tab.1 Colony features of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer

表2 夏季桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌16S rDNA 序列比對結(jié)果Tab.2 16S rDNA sequence identification results of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer

圖1 夏季桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌16S rDNA 的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 16S rDNA PCR products of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 夏季桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌16S rDNA序列的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 N-J phylogenetic tree of culturable bacteria from Leptocybe invasa in summer based on 16S rDNA sequences

對測序得到的夏季桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的16S rDNA 序列進行系統(tǒng)進化分析（圖2）。結(jié)果表明夏季桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌可歸入15 個屬，分別在進化樹上形成了獨立的分支，其中DH2、DH3、DH5、DH9、DH13 形成以變形菌門為家族的分枝，DH2、DH3、DH5和DH9 分別屬于γ-變形菌綱的Erwiniaceae 的泛菌屬，假單胞菌科（Pseudomonadaceae）的假單胞菌屬，莫拉氏菌科（Moraxellaceae）的不動桿菌屬和黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）的寡養(yǎng)單胞菌屬，DH13 屬于α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）的根瘤菌科（Rhizobiaceae）的根瘤菌屬；DH10、DH11、DH12、DH1 形成以厚壁菌門為家族的分枝，分別屬于芽孢桿菌綱（Bacilli）的芽孢桿菌科（Bacillaceae）的芽孢桿菌屬，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）的葡萄球菌屬；DH6、DH7、DH8、DH4、DH17、DH16 形成以放線菌門為家族的分支，分別屬于放線菌綱（Actinobacteria）的微桿菌科（Microbacteriaceae）的壤球菌屬、微桿菌屬、短小桿菌屬，類諾卡氏科（Nocardioidaceae）的類諾卡氏菌屬、微球菌科（Micrococcaceae）的微球菌屬，皮桿菌科（Dermabacteraceae）的短狀桿菌屬；DH14、DH15 形成以擬桿菌門為家族的分支，分別屬于噬纖維菌綱（Cytophagia）的噬纖維菌科（Cytophagaceae） 的Dyadobacter屬，黃桿菌綱（Flavobacteriia）的黃桿菌科（Flavobacteriaceae）的金黃桿菌屬。表明變形菌門和放線菌門是夏季桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的優(yōu)勢菌群，其中DH10、DH11、DH12為同一屬，親緣關系最近；DH6、DH7、DH8為同一科，親緣關系次之。

3 結(jié)論與討論

本研究采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和16S r DNA基因測序相結(jié)合的方法分析了夏季桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內(nèi)可培養(yǎng)細菌菌群結(jié)構(gòu)組成，17 株細菌分屬于芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、類諾卡氏屬、不動桿菌屬、壤球菌屬、微桿菌屬、短小桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、根瘤菌屬、Dyadobacter屬、金黃桿菌屬、短狀桿菌屬、微球菌屬，共15個屬。系統(tǒng)進化分析表明，5株細菌屬于變形菌門，6 株細菌屬于放線菌門，4 株細菌屬于厚壁菌門，2株細菌屬于擬桿菌門，變形菌門和放線菌門為優(yōu)勢菌群。已有研究表明，稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）和暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela）幼蟲體內(nèi)細菌的優(yōu)勢群同樣也為變形菌門和放線菌門[9-10]。

前期利用相同的方法對同一地點同一寄主植物上采集的冬季桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內(nèi)可培養(yǎng)細菌進行了分離，共獲得11 株細菌，分別為芽孢桿菌屬3株，微球菌屬2株，葡萄球菌屬、片球菌屬（Pediococcus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、微桿菌屬、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）各1 株，厚壁菌門和放線菌門為優(yōu)勢菌群[11]。夏冬兩季桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內(nèi)可培養(yǎng)細菌的種類組成存在明顯的不同，可能是由于桉樹枝癭姬小蜂的生理代謝和生命周期不同造成的。俞英豪[12]對春秋兩季大青葉蟬（Cicadella viridis）腸道細菌多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)其腸道優(yōu)勢菌群存在較大的差異。楊志波等[13]研究發(fā)現(xiàn)越夏期和越冬期意大利蜜蜂（Apismellifera ligustica）腸道細菌的菌群結(jié)構(gòu)明顯不同。

一些研究表明，葡萄球菌可對宿主的生長發(fā)育產(chǎn)生積極的影響，假單胞菌可提高宿主的免疫反應，不動桿菌在宿主體內(nèi)可參與營養(yǎng)代謝過程，短狀桿菌和泛菌屬可增強宿主的抗性，寡養(yǎng)單胞菌對角蛋白有一定的降解能力，根瘤菌和假單胞菌具有水解纖維素的能力，協(xié)助宿主合成碳氮類營養(yǎng)物質(zhì)[14-21]。本研究在桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內(nèi)也分離到了葡萄球菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、短狀桿菌屬、泛菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和根瘤菌屬細菌，這些細菌是否在桉樹枝癭姬小蜂的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、抗性等方面發(fā)揮作用有待進一步研究。