魏冬梅 段魏魏 陳真 王詠星

摘要：在對(duì)新疆五家渠地區(qū)15株魚類水霉病病原菌18S rDNA克隆測序的基礎(chǔ)上，探討相比傳統(tǒng)分類方法，運(yùn)用18S rDNA序列進(jìn)行分子鑒定對(duì)水霉菌分類的可行性。結(jié)果顯示，用MEGA 5.0軟件構(gòu)建鄰接（NJ）樹和最大似然（ML）樹進(jìn)行分類，15株病原菌中LF04、LF01、JX03、JX01為寄生水霉，HL04、JY07、HZ、JY10、LY04、JY15、HL01為鐮刀菌，JX02為腐霉，JY06未鑒定出結(jié)果，與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果差異巨大。

關(guān)鍵詞：水霉病;系統(tǒng)發(fā)育樹;分類;18S rDNA

中圖分類號(hào)： S941.43+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）15-0194-06

水霉?。╯aprolegniasis）又稱膚霉病、白毛病，是威脅淡水魚類養(yǎng)殖的世界性病害，在很多淡水魚的成魚、魚苗、魚卵中都會(huì)發(fā)病。水霉病的病原目前已發(fā)現(xiàn)有幾十種，主要是真菌門鞭毛菌亞門藻狀菌綱水霉目水霉科的水霉屬和綿霉屬以及霜霉目腐霉科的腐霉屬和疫霉屬[1-3]，宿主一般在受傷之后易感染水霉病[4]。水霉病病原菌通常具有一些真菌特征，但其作為非真菌的類真菌生物，對(duì)于其分類地位尚存爭議[5]。目前，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，許多分子生物學(xué)手段已用于水霉的分類學(xué)研究[6-10]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）區(qū)域與18S rDNA因其高度保守且種間甚至種內(nèi)高度變異被廣泛應(yīng)用于真菌種間分析和種的鑒定。新疆獨(dú)特的氣候特點(diǎn)使魚類在經(jīng)歷嚴(yán)冬后的初春易患水霉病，魚類水霉病的病情較我國其他地區(qū)更為嚴(yán)峻，而目前未見相關(guān)研究，因此對(duì)新疆地區(qū)魚類水霉病病原菌的分離鑒定十分必要。

對(duì)于初學(xué)者而言，構(gòu)建鄰接（NJ）樹和最大似然（ML）樹，一般采用MEGA軟件[11]。MEGA是Nei開發(fā)并設(shè)計(jì)的圖形化軟件，使用方便快捷。本研究以新疆五家渠地區(qū)分離純化所得15株水霉病病原菌18S rDNA區(qū)域?yàn)榉肿訕?biāo)記，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并與形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果作對(duì)比，以期彌補(bǔ)國內(nèi)水霉分類研究的不足，并為魚類水霉病的病原鑒定及后期藥物防治的研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：由筆者所在實(shí)驗(yàn)室早期分離純化（于2010—2017年自新疆五家渠市水產(chǎn)養(yǎng)殖基地采樣，帶回實(shí)驗(yàn)室分離純化菌種并進(jìn)行形態(tài)、18S rDNA測序分析等相關(guān)試驗(yàn)）獲得并進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。其中，HL01、HL02和HL04分離自新疆五家渠患病河鱸魚病灶處，HZ、HZ02分離自新疆五家渠患病虹鱒魚病灶處，JX01、JX02、JX03分離自新疆五家渠患病江雪魚病灶處，JY06、JY07、JY10、JY15分離自新疆五家渠患病鯽魚病灶處，LF01、LF04分離自新疆五家渠患病羅非魚病灶處，LY04分離自新疆五家渠患病鰱魚病灶處。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化 從長滿水霉菌絲的平板上切取直徑為 1 cm 的水霉瓊脂塊接種于水霉培養(yǎng)基平板中央，25 ℃培養(yǎng) 3～4 d。

1.2.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）裂解法提取基因組DNA[12]，利用1%瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物。將分離的PCR產(chǎn)物與病原菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 序列比對(duì)及遺傳距離分析 序列采用Sequencing Analysis 5.2（Applied Biosystems）軟件反復(fù)進(jìn)行校對(duì)，去除兩端不確定的序列后，在GenBank中進(jìn)行BLAST比較搜索，同時(shí)下載同源性序列。采用Clustal X 2.1對(duì)所選序列進(jìn)行比對(duì)。采用MEGA 5.0 1軟件中的Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算種間的遺傳距離。

1.2.4 MEGA 5.0系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 在GenBank中進(jìn)行BLAST比較搜索，下載同源性序列，用MEGA 5.0軟件構(gòu)建 Neighbour-Joining（NJ） 樹和Maximum Likelihood（ML） 樹，自舉值（Bootstrap）分析均采用1 000次重復(fù)抽樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 18S rDNA PCR與測序結(jié)果

所得水霉病病原菌18S rDNA PCR瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖1。結(jié)果顯示，測序得到的序列大小在1 300～1 400 bp 之間，在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中，用所得序列進(jìn)行BLAST比較搜索，得到其同源序列，本研究中其他30條BLAST序列的GenBank登錄號(hào)如下：Fusarium graminearum（XR_893069.1）、Fusarium graminearum（XR_893066.1）、Fusarium graminearum（XR_893063.1）、Fusarium oxysporum（KR611565.1）、Fusarium oxysporum（JN604548.1）、Fusarium oxysporum（KM250373.1）、Fusarium oxysporum（JF807401.1）、Fusarium oxysporum（KR611565.1）、Fusarium sp. （EU710815.1）、Fusarium sp.（KU170627.1）、Fusarium sp. （JX273060.1）、Fusarium sp.（EU710821.1）、Gibberella sp.（KT351617.1）、Gibberella sp.（KT351617.1）、Gibberella fujikuroi（AB237662.1）、Cordyceps confragosa（AB111495.1）、Cordyceps confragosa（AB079127.1）、Cordyceps caloceroides（AY245654.1）、Pythiaceae sp.（FJ794931.1）、Pythiaceae sp.（FJ794935.1）、Paecilomyces hepiali（HM135172.1）、Pleosporales sp.（KM096319.1）、Pleosporales sp.（KM096309.1）、Saprolegnia parasitica（AB086898.1）、Saprolegnia parasitica（AB086899.1）、Saprolegnia parasitica（XR_001099855.1）、Saprolegnia parasitica（XR_001099850.1）、Saprolegnia ferax（AJ238655.1）、Uncultured Dikarya（HQ219381.1）、Uncultured Dikarya（HQ191403.1）。

2.2 18S rDNA序列的遺傳距離分析

采用MEGA 5.0 1軟件中的Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算種間的遺傳距離。由表1可知，LF01、LF04、JX01、JX03這4 株菌與Saprolegnia parasitica（寄生水霉）菌株的遺傳距離最近在0.000～0.002之間;JY07、JY10、JY15、HZ、LY04、HL01、HL04等7株菌與Fusarium oxysporum（尖孢鐮刀菌）和Fusarium graminearum（禾谷鐮刀菌）的遺傳距離最近在0.001～0.006之間;JX02與Pythiaceae sp.（腐霉）的遺傳距離最近在 0.000～0.001之間。

2.3 MEGA 5.0軟件序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

將NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST得到的同源序列用MEGA 5.0構(gòu)建Neighbour-Joining樹和Maximum Likelihood樹，由圖2、圖3可知，運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建的NJ樹和ML樹，因2種算法差異，使2種樹在遺傳距離和小的聚群排列上有細(xì)微不同。但在大的聚類上，都可以將15株菌株分為2個(gè)大的聚群，根據(jù)大聚群分枝，15株菌大致分成了5類結(jié)果。由表2可知，LF01、LF04、JX01和JX03聚類在鞭毛菌門卵菌綱水霉目水霉科水霉屬的寄生水霉;HZ、JY15、LY04、HL01、JY07、HL04和JY10聚類在子囊菌亞門肉座菌科赤霉屬的尖孢鐮刀菌或禾谷鐮刀菌;JX02聚類在鞭毛菌門卵菌綱霜霉目腐霉科腐霉屬腐霉;HL02聚類在蟲草科;JY06未知。

2.4 15株菌18S rDNA序列比對(duì)與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果比較

查閱筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期工作總結(jié)《新疆五家渠水霉病原菌多樣性的初步研究》與《魚類水霉病原真菌的分離篩選》形態(tài)分類鑒定結(jié)果[13-14]，與18S rDNA序列分類鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，由表3可見，2種分類方法結(jié)果差異明顯。除LF01、LF04、JX01、JX03這4株菌都被分在水霉屬外，其余菌均不在同一屬，甚至科、目都不相同。

3 討論

依據(jù)傳統(tǒng)分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，水霉屬鑒定主要依據(jù)第1代游動(dòng)孢子的釋放模式，種的鑒定則要求對(duì)藏卵器、雄器及卵孢子分化位置及數(shù)目等有性器官作詳細(xì)的描述[15]。水霉的生活史復(fù)雜，進(jìn)一步提升了對(duì)其分類的難度[16]，且很多從魚體病灶處分離純化的水霉，通常在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下不能或很難形成有性器官，有些種的有性器官在不同的生活環(huán)境中形狀不穩(wěn)定[17-19]。因此，應(yīng)用傳統(tǒng)的分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)很難甚至無法將病灶處水霉鑒定到種的水平。本研究中所用的15株菌，在形態(tài)觀察的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，在不同的培養(yǎng)基，或相同培養(yǎng)基不同溫度、不同pH值等條件下培養(yǎng)時(shí)，其菌落特征及無性形態(tài)特征均有差異。在對(duì)15株菌進(jìn)行形態(tài)鑒定的過程中發(fā)現(xiàn)，水霉科的屬特征與毛霉科、半知菌類的一些特征存在交叉，在形態(tài)鑒定時(shí)不能完全確定為哪個(gè)屬，因?yàn)檫@些菌是在患水霉病的魚體中分離獲得的，最終按水霉科來進(jìn)行形態(tài)分類，故形態(tài)分類結(jié)果可能存在偏差。再者水霉病的病原種類繁多，其病原范圍可能更廣。

對(duì)于水霉菌的分子鑒定，國內(nèi)外研究也較少，從而使數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)量較少，無法從數(shù)據(jù)庫中得到足夠數(shù)據(jù)，故搜索到的同源序列大多為其他種屬序列， 導(dǎo)致在分子分類分析時(shí)出現(xiàn)偏差。真菌全基因組GC含量具有種間特異性，但由于測序分

析的困難，故一般選用18S rDNA或ITS rDNA作分子分類分析，這種分類本身也存在一些偏差。綜上，導(dǎo)致形態(tài)分類結(jié)果與分子分類結(jié)果差異巨大。

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