路偉 李鋼 周奮 劉仲海

[摘 要] 目的 探討顱腦損傷（TBI）患者入院時(shí)外周血miR-130a和miR-132水平對(duì)病情嚴(yán)重程度的早期診斷價(jià)值，以及對(duì)重型顱腦損傷（sTBI）患者發(fā)病6個(gè)月預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法 選擇在我院救治的158例TBI患者和30例健康志愿者作為對(duì)照組納入研究，根據(jù)格拉斯昏迷評(píng)分（GCS），將TBI患者分為輕度（mTBI）組、中度（msTBI）組和重度（sTBI）組。采用基因芯片技術(shù)篩選四組受試對(duì)象有表達(dá)差異的miRNAs，并篩選靶基因明確的miRNAs進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。隨訪6個(gè)月，根據(jù)格拉斯預(yù)后評(píng)分（GOS），將患者分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組。建立受試者工作特征（ROC）曲線確定外周血miRNAs對(duì)預(yù)后診斷的臨界值。結(jié)果 經(jīng)基因芯片分析選擇miR-130a和miR-132作為目標(biāo)miRNA，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)，與對(duì)照組受試者相比，三組TBI患者外周血中miR-130a表達(dá)均顯著上調(diào)，同時(shí)miR-132表達(dá)量顯著下調(diào)（均P<0.05）。而且以sTBI組患者外周血miR-130a水平為最高，miR-132水平為最低。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，TBI患者入院時(shí)GCS評(píng)分和外周血miR-130a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（rs=-0.79，P<0.05），而和miR-132表達(dá)呈正相關(guān)性（rs=0.74，P<0.05）。根據(jù)6個(gè)月隨訪結(jié)果，39例患者預(yù)后良好，26例患者預(yù)后不良。預(yù)后良好組患者外周血miR-130a水平低于預(yù)后不良組患者（P<0.05），同時(shí)miR-132水平高于預(yù)后不良組患者（P<0.05）。經(jīng)ROC曲線分析，入院時(shí)外周血miR-130a和miR-132水平對(duì)sTBI患者6個(gè)月預(yù)后預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.74（95%CI 0.57～0.87）、0.70（95%CI 0.63～0.85），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而miR-130a和miR-132聯(lián)合預(yù)測(cè)mTBI患者預(yù)后的ROC曲線AUC明顯高于單項(xiàng)指標(biāo)（P<0.05）。結(jié)論 TBI患者入院時(shí)外周血miR-130a和miR-132水平可早期評(píng)估疾病嚴(yán)重程度，并且可作為sTBI患者近6個(gè)月預(yù)后的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 重型顱腦損傷;基因芯片;微小RNA-130a;微小RNA-132;近期預(yù)后

中圖分類號(hào)：R651.1+5? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1009-816X（2019）04-0299-05

[Abstract] Objective To explore the expression of serum miR-130a and miR-132 in patients with traumatic brain injury （TBI） and the predictive value on short-time （6 months） prognosis of patients with severe traumatic brain injury （sTBI）. Methods 158 TBI patients were divided into mTBI group， msTBI group and sTBI group according to Glasgow coma score，and 30 healthy volunteers were selected as control group. Using gene chip technology to filtrate different miRNAs in four groups ， then miRNAs with target gene were validated by fluorogenic quantitative PCR. According to Glasgow outcome score （GOS） after injury 6 months， TBI patients were divided into patients with good prognosis and patients with poor prognosis. Receiver operating characteristic （ROC） curve was built to analyze the predictive value of serum miRNAs at admission on short-time prognosis of patients. Results Choosing miR-130a and miR-132 as target miRNA through gene chip technology analysis. Validated by fluorogenic quantitative PCR， the expression of miR-130a in mTBI， msTBI， sTBI patients were increased gradually （P<0.05）， and the expression of miR-132in mTBI， msTBI， sTBI patients were declined gradually （P<0.05）. And the sTBI patients had highest level of miR-130a and lowest level of miR-132 than these of mTBI and msTBI patients （all P<0.05）. Spearman correlation analysis showed that the GCS score and miR-130a was negative related （rs=-0.79，P<0.05）， while GCS score and miR-132 was positive related （rs=0.74，P<0.05）. After followed up 6 months， there were 39 patients with good prognosis and 26 patients with poor prognosis. The level of miR-130a in good prognosis group was lower than that in poor prognosis group， the level of miR-132 in good prognosis group was higher than that in poor prognosis group （P<0.05）. The area under ROC curve of miR-130a and miR-132 at admission on prediction of prognosis of sTBI patients were 0.74 （95% CI： 0.57～0.87） and 0.70 （95% CI： 0.63～0.85）， which was lower than combined predictive value of miR-130a and miR-132 （P<0.05）. Conclusions Serum miR-130a and miR-132 at admission is closely related with the severity of disease， which could be the early sensitive predictors of prognosis in sTBI patients in 6 moths.

[Key words] Severe traumatic brain injury （sTBI）; Gene chip; MiR-130a;MiR-132; Short-time prognosis

重型顱腦損傷（severe traumatic brain injury，sTBI）是重癥監(jiān)護(hù)病房收治的最常見的危急重癥之一，起病急，病情進(jìn)展迅速、死亡率極高[1]。如何對(duì)患者病情嚴(yán)重程度以及預(yù)后迅速做出初步且準(zhǔn)確的判斷，并與患者家屬溝通病情以及生存評(píng)估是神經(jīng)外科醫(yī)師最為棘手的問題。目前，電子計(jì)算機(jī)斷層掃描以及磁共振成像可以幫助醫(yī)師了解患者顱內(nèi)腦組織損傷情況，但是尚不能完全準(zhǔn)確地評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度[2]。而顱內(nèi)壓、血壓、血氧等指標(biāo)具有一定的滯后性，易延誤治療時(shí)機(jī)[3]。因此尋找敏感度和特異度較高且操作便捷的檢測(cè)對(duì)象，對(duì)于完善sTBI的病情監(jiān)測(cè)、治療選擇以及預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床價(jià)值。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類長(zhǎng)度約19～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，多數(shù)真核細(xì)胞中的miRNAs定位于基因間隔區(qū)，具有高度保守序列[4]。2008年，Mitchell等[5]學(xué)者發(fā)現(xiàn)外周血中也存在穩(wěn)定表達(dá)的miRNAs，并且不受到核糖核酸酶降解的影響。在本項(xiàng)研究中，首先通過Agilent高通量基因芯片技術(shù)（miRBase V21.0）篩查sTBI患者外周血中的特異性miRNAs表達(dá)譜，以尋找可用于sTBI早期診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志分子，同時(shí)也為sTBI發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2016年9月至2018年1月期間由我院重癥醫(yī)學(xué)科和神經(jīng)外科收治的TBI患者158例，男113例，女45例，年齡18～78歲，平均（57.38±13.45）歲。根據(jù)入院時(shí)格拉斯昏迷評(píng)分（glasgow coma score，GCS）[6]，13～15分為輕度TBI（mTBI組）共59例;9～12分為中度TBI（msTBI組）共34例;3～8分為重度TBI（sTBI組）共65例。其中，意外交通事故94例，高處下墜傷31例，重物砸傷25例，其他傷害8例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲;（2）損傷后24h內(nèi)入院者;（3）入院后至少接受1次顱腦CT檢查，并證實(shí)存在腦挫裂傷并伴發(fā)不同程度的顱內(nèi)血腫和顱骨骨折者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）創(chuàng)傷前存在顱腦病變者;（2）腹腔、胸腔、四肢等其他部位嚴(yán)重?fù)p傷導(dǎo)致低血壓和低血氧等主要生命體征異常者;（3）合并高血壓、糖尿病等慢性疾病者，急慢性感染者，肝腎等嚴(yán)重功能不全者以及其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病者;（4）近3個(gè)月內(nèi)有手術(shù)史、創(chuàng)傷史或者輸血史者。該實(shí)驗(yàn)的所有過程均遵從赫爾辛基宣言標(biāo)準(zhǔn)，該研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且在充分告知可能存在的風(fēng)險(xiǎn)后與所有患者家屬簽署了知情同意書。另外選擇同時(shí)期在我院健康體檢中心進(jìn)行體格檢查且完全正常的健康志愿者30例作為對(duì)照組，男22例，女8例，年齡24～80歲，平均（58.96±14.37）歲。對(duì)照組和TBI組患者年齡和性別組成基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。

1.2 方法：

1.2.1 血液樣本采集：患者入院后立即采取外周靜脈血3mL置于肝素鈉真空采血管（美國(guó)BD公司），另外收集對(duì)照組體檢時(shí)的血液樣本，室溫靜置20min，1500r/min離心10min（離心半徑8cm），取上清液，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 miRNAs芯片檢測(cè)及分析：采用Agilent高通量基因芯片技術(shù)（miRBase V21.0，G4872A），檢測(cè)樣本來(lái)自于對(duì)照組、mTBI組、msTBI組和sTBI組各5例，四組受試對(duì)象的年齡、性別組成基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。按照TRIzol試劑盒（Invitrogen公司，美國(guó)）和mirPremiermicroRNA Isolation Kit（Invitrogen公司，美國(guó)）說(shuō)明書提取外周血miRNA，并采用NanoDrop 1000檢測(cè)miRNA的純度。用標(biāo)記酶Hy3TM熒光標(biāo)記miRNAs，得到與芯片雜交的熒光探針。

1.2.3 熒光定量PCR：采用TRIzol試劑盒提取外周血總RNA，采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行。根據(jù)使用說(shuō)明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 sTBI患者的急救方法：sTBI患者接受院前急救和院內(nèi)急救，在受傷現(xiàn)場(chǎng)或運(yùn)送途中給予呼吸機(jī)維持呼吸、外周靜脈補(bǔ)液、壓迫止血和固定等措施。進(jìn)入重癥監(jiān)護(hù)室后，有57例患者接受神經(jīng)外科手術(shù)治療，給予去骨瓣減壓+血腫清除術(shù)或者微創(chuàng)血腫碎吸手術(shù)，腦室出血者進(jìn)行微創(chuàng)腦室鉆孔外引流;其余8例患者進(jìn)行保守治療。

1.2.5 sTBI患者的隨訪和預(yù)后評(píng)估：采用電話、家訪或門診復(fù)診方式進(jìn)行6個(gè)月隨訪，對(duì)所有患者進(jìn)行格拉斯預(yù)后評(píng)分（glasgow outcome score，GOS）[8]，死亡為1分;植物生存為2分;重度病殘，意識(shí)清楚但生活不能自理為3分;中度病殘，生活能自理為4分;恢復(fù)良好，正常生活但有輕度神經(jīng)障礙為5分。GOS≤3分為預(yù)后不良，>3分為預(yù)后良好。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：將資料輸入SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x -±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。建立受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線確定miRNA對(duì)sTBI的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本文還發(fā)現(xiàn)外周血miR-130a和miR-132水平與6個(gè)月預(yù)后有關(guān)。這主要與顱腦損傷過程中伴有的炎癥反應(yīng)有關(guān)。既往有學(xué)者通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提出，miR-130a屬于血管新生中靶向抑制血管新生轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)抑制特異性同源框蛋白GAX以及HOXA5蛋白的miRNA，與腦組織損傷后腦血腫的形成有關(guān)[13]。有學(xué)者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血清中miR-130a的表達(dá)量與腦血腫周圍腦組織中miR-130a的表達(dá)量一致，是反映腦水腫程度的重要指標(biāo)[14]。而miR-132分子已經(jīng)被證實(shí)可以靶向抑制乙酰膽堿酯酶的表達(dá)和活性，從而增加乙酰膽堿的水平以及其抗炎作用。另外，miR-132在腦組織的發(fā)育、樹突細(xì)胞的起源、突觸形成和成熟中均發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[15]。因此血清中miR-132含量的高低也是反應(yīng)TBI患者腦組織炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)?；谏鲜鰴C(jī)制分析，本文通過ROC曲線證實(shí)，入院時(shí)sTBI患者外周血miR-130a和miR-132水平對(duì)sTBI患者預(yù)后預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是聯(lián)合這兩項(xiàng)指標(biāo)的預(yù)測(cè)價(jià)值較高。

綜上所述，入院時(shí)外周血miR-130a和miR-132水平檢測(cè)有望成為早期評(píng)估TBI患者疾病嚴(yán)重程度，并及時(shí)預(yù)估近6個(gè)月預(yù)后的重要指標(biāo)，對(duì)于現(xiàn)有的疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)后預(yù)測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行了一定的補(bǔ)充，有一定的臨床價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]袁杰，霍春芬.重型顱腦損傷術(shù)后患者預(yù)后現(xiàn)狀和影響因素分析[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2014，17（1）：3-6.

[2]Qualls D， Leonard JR， Keller M， et al. Utility of magnetic resonance imaging in diagnosing cervical spine injury in children with severetraumatic brain injury[J]. J Trauma Acute Care Surg，2015，78（6）：1122-1128.

[3]Banoei MM， Casault C， Metwaly SM， et al. Metabolomics and biomarker discovery in traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma，2018，35（16）：1831-1848.

[4]Di Pietro V， Ragusa M， Davies D， et al. MicroRNAs as novel biomarkers for the diagnosis and prognosis of mild and severe traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma， 2017， 34（11）：1948-1956.

[5]Mitchell PS， Parkin RK， Kroh EM， et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（30）：10513-10518.

[6]王小剛，高丁，李濤，等.院前應(yīng)用格拉斯哥昏迷分級(jí)評(píng)分評(píng)估顱腦損傷患者與預(yù)后的相關(guān)性分析[J].中國(guó)臨床醫(yī)生雜志，2015，43（8）：36-39.

[7]李春偉，伊志強(qiáng)，李良.重型創(chuàng)傷性顱腦損傷的治療進(jìn)展[J].中國(guó)微創(chuàng)外科雜志，2016，20（7）：656-660.

[8]秦燕，周順科，劉軍.多種MRI技術(shù)在輕型顱腦損傷中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].磁共振成像，2015，6（3）：235-240.

[9]周小龍，宋建榮，呂新文，等.miR-93、miR-191、miR-499在顱腦損傷患者血清中的表達(dá)及其臨床意義[J].卒中與神經(jīng)疾病，2016，23（6）：399-403.

[10]馬永盛，陳亮，衣蘭凱.GCS和ICS及APACHEⅡ三種臨床評(píng)分對(duì)昏迷患者的預(yù)后評(píng)估[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2008，11（1）：1761-1762.

[11]Deepika A， Devi BI， Shukla D， et al. Neuroimmunology of traumatic brain injury： a longitudinal study of interdependency of inflammatory markers and heart rate variability in severe traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma，2018，35（10）：1124-1131.

[12]陳吉鋼，張丹楓，魏嘉良，等.創(chuàng)傷性眶上裂綜合征的治療[J].中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志，2016，21（4）：200-202.

[13]Chen Y， Gorski DH. Regulation of angiogenesis through a microRNA （miR-130a） that down-regulates antiangiogenic homeobox genes GAX and HOXA5[J]. Blood，2008，111（3）：1217-1226.

[14]Wang Y， Wang MD， Xia YP， et al. MicroRNA-130a regulates cerebral ischemia-induced blood brain barrier permeability by targeting Homeobox A5[J]. FASEB J，2018，32（2）：935-944.

[15]Che F， Du H， Zhang W， et al. MicroRNA-132 modifies angiogenesis in patients with ischemic cerebrovascular disease by suppressing the NFκB and VEGF pathway[J]. Mol Med Rep，2018，17（2）：2724-2730.