朱曉燕 宋華峰 陳慧 吳敏娟 趙妮娜 胥萍

目前抗酸染色(AFS)和分枝桿菌培養(yǎng)仍然是臨床診斷結(jié)核病的常用技術[1]。隨著診斷技術的發(fā)展，核酸雜交探針、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)和DNA測序等分子技術越來越多的用于菌種鑒定[2-4]。通過核酸擴增可以直接檢測呼吸道標本中的結(jié)核分枝桿菌復合物[5]，而不需要通過細菌培養(yǎng)檢測方法，從而使長達2個月的結(jié)核病診斷縮短至6 h完成。非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacterium, NTM)肺病，會表現(xiàn)為咳嗽、疲勞和呼吸短促等癥狀，與結(jié)核分枝桿菌感染所致的臨床癥狀相似，但治療方案不同，臨床鑒別診斷困難[6]。因此，有效地鑒定結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌具有重要意義。目前臨床上以IS 6110為基礎的限制性片段長度多態(tài)性(IS 6110-RLFP)[7]、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析[multiple-locus VNTR(variable-number tandem repeats) analysis，MLVA]、Spoligotyping法等3種技術在分枝桿菌的檢測中應用最廣泛[8-9]。其中Spoligotyping法是一種基于PCR的檢測結(jié)核分枝桿菌DNA直接重復區(qū)(DR)的基因分型方法，利用Spoligotyping法進行寡核苷酸分型，其結(jié)果可分析重復序列是否存在來鑒定分枝桿菌，并與建立的SITVIT2數(shù)據(jù)庫進行比較。

傳統(tǒng)的Spoligotyping法是采用固相膜雜交技術鑒定間隔子PCR產(chǎn)物，操作上需要進行變性、雜交、酶聯(lián)、暗室發(fā)光顯影等多個步驟，檢測時間長[3, 10-11]。本研究采用的方法是寡核苷酸探針雜交的結(jié)核分支桿菌間隔區(qū)寡核苷酸分型方法，有如下改進措施：(1)將單鏈寡核苷酸探針固定在硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane, NC 膜)和尼龍膜上。(2)對DNA模板采用不對稱的引物濃度擴增。(3)直接將單鏈PCR產(chǎn)物在芯片上與反應液進行混合反應，根據(jù)反應后的顯色結(jié)果判斷結(jié)核分枝桿菌的類型。該方法相對于傳統(tǒng)Spoligotyping固有膜雜交法具有一定的優(yōu)點，包括擴增產(chǎn)物為單鏈DNA片段，不需要雜交前變性，操作步驟少、實驗周期短、效率高、顯色無需在暗室發(fā)光顯影，簡單易行。本研究選擇了蘇州市第五人民醫(yī)院2017年11月至2018年12月門診和住院患者送檢的痰液標本，擬通過此新方法對臨床結(jié)核分枝桿菌進行檢測并與非結(jié)核分枝桿菌進行鑒別診斷，從而來判斷該方法是否能夠更快速、更有效地提高診斷效能，以期為后續(xù)臨床檢測分枝桿菌提供快速、有效、準確的方法。

資料和方法

一、 研究對象

收集我院2017年1月至2018年12月間收治的疑似肺結(jié)核患者的痰液標本495份，其中男275例(55.6%)，女220例(44.4%)；年齡為14～85歲，平均年齡(46±14)歲。

二、標本采集

事先向患者交待好痰液標本留取注意事項，患者按要求在留痰前用清水漱口，然后用力咳嗽，將從深處咳出的痰液放于一次性無菌痰瓶，每份標本痰液量約3～5 ml，蓋好蓋子后立即送檢。

三、儀器和試劑盒

BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)培養(yǎng)管(美國BD公司)，MGIT 960結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司)，分枝桿菌羅氏培養(yǎng)基(簡稱“L-J培養(yǎng)基”；珠海貝索生物技術有限公司)，微孔板恒溫振蕩器(杭州佑寧儀器有限公司)、基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)、間隔區(qū)寡核苷酸芯片試劑盒(江蘇獵陣生物科技有限公司)。

四、研究方法

將所有的痰液標本分別采用MGIT 960培養(yǎng)法、選擇性培養(yǎng)基法(含有500 mg/L PNB羅氏培養(yǎng)基，簡稱“L-J培養(yǎng)基法”)及Spoligotyping法檢測。

1.MGIT 960培養(yǎng)法：①標本處理時，首先將1～2 ml痰液轉(zhuǎn)移至離心管中，用4%氫氧化納(NaOH)液化， 然后進行振蕩、混勻，再靜置30 min，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)進行中和，再將標本離心后棄去上清，加入0.5 ml生理鹽水，吹打、混勻。②接種時，首先吸取 0.5 ml已處理標本加入至MGIT 960培養(yǎng)管中，再將該培養(yǎng)管置入MGIT 960培養(yǎng)儀中進行培養(yǎng)。

2. L-J培養(yǎng)基法鑒定非結(jié)核分枝桿菌：① 菌液制備。先挑取生長良好的菌落，與磨菌管底部的PBS混合均勻，再配備不同濃度的菌懸液；②菌液接種。首先用接種環(huán)沾取1滿環(huán)(約0.01 ml)不同稀釋倍數(shù)菌懸液，用劃線法均勻涂布于各培養(yǎng)基表面。③絕大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌菌株能在含有500 mg/L PNB羅氏培養(yǎng)基上能生長，而結(jié)核分枝桿菌卻不能耐受。

3. Spoligotyping法：需要進行如下步驟。

(1)DNA提?。河梅种U菌DNA核酸提取試劑盒提取DNA。將提取好的DNA置于2～8 ℃冰箱冷藏， 并在3 d內(nèi)使用。陰性對照品作為質(zhì)量控制的參照。(2)PCR擴增：利用不對稱引物濃度擴增DNA模板。(3)分枝桿菌菌種鑒定芯片檢測：在另外一個房間內(nèi)進行雜交。(4)質(zhì)量控制標準：陰性對照品的膜芯片除雜交質(zhì)控探針(HC)、擴增質(zhì)控探針(PC，用于質(zhì)控雜交過程)位置有顯色點外，其他位置均不顯色，有顯色則表明很有可能出現(xiàn)污染情況；陽性對照品的膜芯片。非結(jié)核分枝桿菌探針判讀：當檢測15種檢測范圍內(nèi)的非結(jié)核分枝桿菌時，非結(jié)核分枝桿菌探針必定有信號。(5)結(jié)果判讀：當HC和PC探針均為陽性，NC探針陰性時，判斷結(jié)果是有效的。然后，將各應變識別探針的顯色結(jié)果與陣列芯片的陣列圖進行比較，并進行解讀分枝桿菌的菌種類型。

五、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、L-J培養(yǎng)基法對分枝桿菌的鑒定結(jié)果

通過MGIT 960培養(yǎng)法及L-J培養(yǎng)基法檢測495例疑似肺結(jié)核患者痰液標本，其中495例(份)標本檢出結(jié)核分枝桿菌426例(86.1%)，包括人型405例，牛型21例；非結(jié)核分枝桿菌69例(13.9%)。

二、Spoligotyping法對分枝桿菌的鑒定結(jié)果

采用Spoligotyping法在495例(份)檢測標本中檢出結(jié)核分枝桿菌420例(84.8%)；非結(jié)核分枝桿菌75例(15.2%)，包括鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌、其他分枝桿菌(表1)。

表1 Spoligotyping法對495例(份)痰標本進行分枝桿菌檢測鑒定的結(jié)果

表2 以MGIT 960培養(yǎng)法及L-J培養(yǎng)基法檢測結(jié)果為參考標準評價Spoligotyping法在分枝桿菌菌種快速鑒定中的效能

注敏感度=a/(a+c)×100%；特異度=d/(b+d)×100%；陽性預測值=a/(a+b)×100%；陰性預測值=d/(c+d)×100%；符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%；a：真陽性例數(shù)；b：假陽性例數(shù)；c：假陰性例數(shù)；d：真陰性例數(shù)

三、以MGIT 960培養(yǎng)法及L-J培養(yǎng)基法檢測結(jié)果為參考標準評價Spoligotyping法在分枝桿菌菌種快速鑒定中的效能

以MGIT 960培養(yǎng)法及L-J培養(yǎng)基法檢測結(jié)果為參考標準評價Spoligotyping法在分枝桿菌菌種快速鑒定中的效能如下：敏感度為96.7%(412/426)，特異度為88.4%(61/69)，陽性預測值為98.1%(412/420)，陰性預測值為81.3%(61/75)，診斷符合率為95.5%(473/495)，Kappa值為0.821，具有較高的一致性(表2)。

討 論

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，主要通過空氣中的飛沫核傳播，在發(fā)展中國家仍然是導致疾病死亡的主要原因[12-13]。雖然結(jié)核病的診斷有了迅猛進展，但仍然存在問題，主要原因是難以區(qū)分活動性結(jié)核病患者和已治愈的患者[14]。目前，仍靠傳統(tǒng)的診斷方法，如Ziehl-Neelsen染色、熒光染色及痰培養(yǎng)，其中顯微鏡和培養(yǎng)仍然是結(jié)核病實驗室診斷的主要支柱[15]。雖然結(jié)核菌素試驗在過去的80多年時間里促進了結(jié)核病的診斷，但其往往會出現(xiàn)檢測結(jié)果的假陽性、假陰性?？顾崛旧栃酝科竺亢辽狄汉?04個抗酸桿菌，且抗酸染色無法識別其他抗酸微生物[16]。BACTEC 460和BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)檢測技術縮短了培養(yǎng)時間，但不能識別結(jié)核分枝桿菌復合群或非結(jié)核分枝桿菌。如何進一步鑒定到菌種，需要建立一種更快速及準確、簡便的檢測方法。

基因芯片技術將核苷酸靶序列雜交并結(jié)合在硅片、玻片、硝化膜或塑料片上的探針上，能夠大規(guī)模檢測，具有高通量、高特異度[2, 12, 17]。 Chang等[4]選擇13個M.tuberculosis特異性靶基因構建了快速診斷的基因芯片。采用膜陣列法，對疑似肺結(jié)核患者的痰標本進行基因芯片直接診斷，發(fā)現(xiàn)膜陣列法檢測結(jié)核分枝桿菌的檢出率較限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術、抗酸染色法高(分別為85%、62.5%、70%)，因而認為膜陣列法可直接檢測痰中結(jié)核分枝桿菌，具有快速檢測和亞種鑒定的優(yōu)點，可用于結(jié)核病的防治。

本研究中非結(jié)核分枝桿菌占15.2%(75/495)，在這些非結(jié)核分枝桿菌中，堪薩斯分枝桿菌及胞內(nèi)分枝桿菌分別占38.7%(29/75)、36.0%(27/75)。調(diào)查報告顯示，非結(jié)核分枝桿菌分離株在所有分枝桿菌分離株中的比率已經(jīng)從11.1%上升至22.9%[6, 18-19]。非結(jié)核分枝桿菌最常見的菌株是胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌和膿腫分枝桿菌，但各國非結(jié)核分枝桿菌的分離率和菌株分布不盡相同[20-21]。本研究中鳥分枝桿菌復合群的構成比較低(2.6%)，以胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌的構成比最高(分別為38.7%及36.0%)，可能一定程度上反映了蘇州地區(qū)非結(jié)核分枝桿菌的種類分布情況。

綜上所述，通過我們實驗室的初步研究，筆者發(fā)現(xiàn)Spoligotyping法可以輕松、快速、準確地鑒定結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。該方法與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比較，其敏感度、特異度高，具有較高的符合率。該研究有望為我科進一步選擇該方法用于結(jié)核病診療提供數(shù)據(jù)支撐和依據(jù)。